PCR克隆基因,连载体上发现不是目标基因

.同步双酶切同步双酶切是一种省时省力的常用方法.选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步.NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer,以保证100%的酶活性.NEBuffer的组成及

可以制品说明pMD18-TVector、pMD19-TVector是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体.这两种载体分别由pUC18、pUC19载体改建而成,在pUC18、pUC19

用碱性磷酸酶

你得到的cDNA的量是很少的,先放在克隆载体上是为了获得更多的你所需要的cDNA,这样做的话不至于在做完实验后突然发现你要的那个cDNA被你用完了,然后你又要重新再去很复杂的提取

你看,你分别获得了1-1200nt以及1000-1400nt这两段序列,那么中间有200bp长度的序列是重叠的,对吧?也就是说你已经从序列信息上获得了这个CD区所有的序列信息.如果你只是需要序列信息的

已经得到扩增的目的基因片段和克隆载体→对两者分别进行酶切（选要相同的限制性内切酶对两者进行切割）→酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收→克隆载体和目的基因进行连接（一般选用T4连接酶）→大肠杆菌感受态细胞的制

T载体分两种.一种是末端带有A的典型的T载体,这样的T载体可以与taq酶扩增出来的片段连接,另一种是平末端的T载体,这种T载体末端没有A,它用于以pfu或者是phusion这样的高/超保真酶扩增出来的

不管酶切还是PCR,都是间接的结果.要确定克隆的正确,一定要测序的啊.你测个序,问题就迎刃而解了.到底是什么问题也就清楚了.再问：我前些天去遇到一样的问题，酶切鉴定正确，但测序后什么也不是呢再答：所以

1,能看到你的目的基因是否P出来了,2,得到的目的基因是否单一检测后如果是你的目的条带,而且很唯一,就可以做克隆了

克隆载体是环状双链DNA.PCR的原理：首先,当热变性,模板双链分开成两条单链模板然后,两条引物分别结合上各自的模板聚合酶,催化dNTP等进行引物延伸,成为两对长链模板,由于延伸的时间只够完成目的基因

这个您可以去看看新课标人教版的生物选修3现代生物科技专题.里面说了的如果你直接将基因导入细胞,那它是无法表达的.所以你必须要用到载体载体中包含了许多基因转录所需要的物质.比如说,一个基因要转录,就需要

首先要做的就是鉴定质粒的最小复制子.得到最小复制子后将多克隆位点、选择标记基因即可.如果要构建穿梭载体,则需要加上大肠杆菌复制子.或者,直接在大肠杆菌克隆载体非多克隆位点上插入鉴定的最小复制子.如果要

一楼完全没说到重点,二楼正解.你看过测序的结果就知道了,前面的几十个碱基是无法识别的杂峰,最后几百个碱基也是无法识别的杂峰,尽管结果中还是以单个碱基字母的形式给你写出来,但是那是0智商的机器自动记录的

BestreactionforEcoRIishighslatbuffer,whileHindIIIislowsaltbuffer.ManycompanieswilltellyouHindIIIwoul

可以,只要你的PCR扩增特异性够强,没有杂带.这其实就是理论和实际的差距,因为表达载体的扩增效率低,如果一次实验不成功,你还要从PCR步骤做起重新收集DNA,而如果克隆至扩增载体,每次只需扩增质粒回收

是不是你的引物扩出了非特异的条带啊,可能是你引物设计问题,不排除你模板问题.如果只是回收过程中紫外造成的突变,不应该是整个基因都不对,如果其他序列比对没有问题,只是酶切位点的问题,你要考虑是不是突变了

这个你单酶切最好是要过夜,而且跑电泳尽量时间长一些,如果有一条带,就说明差不多完全切开了,如果害怕不安全,可以把这条带切胶回收纯化,用纯化后的连接,自连的可能性会小一些

克隆载体可以使目的基因在宿主中低成本便捷的扩增克隆载体便于稳定保存目的基因克隆载体上有很多合适的酶切位点供选用克隆载体提供验证,如测序,的方法

目的基因是动物的相关基因片段PCR扩增的吗?你采用mRNA还是DNA啊?是扩增16SrDNA?不然怎么会显示杆菌的片段?BLAST比对如此奇怪?应该不会插入错误16组,估计实验操作的问题,或者使用NC

连到载体后扩增有好处：载体相对于基因组或cDNA复杂度降低,扩增出的片段纯度比较高,而且循环数可以很低,如20-25循环切忌用载体扩增时用高循环,否则会有大量smear引物肯定需要加的!mg2+倒可以