ITS1,4引物退火温度

上下引物的Tm最好相似,不能差异太大,不然不好设计退火温度；内参条带很亮,说明RT应该没多大问题,问题可能出现在PCR上.没有目的基因是因为1该基因确实不表达；2你的引物不特意,到NCBI的Prime

这篇文章有详细描述：http://www.springerlink.com/content/h083177466217382/引物OY1(AATAACTTTTCGAATCGCAT)OY2(AAGACT

实际pcr的退火温度一般都是从55℃开始的,有杂带退火温度就提高一点,目的带比较微弱退火温度就降低一点,不用管那个引物单子上的温度,那样太麻烦,有的实验室一天做几百个样品的pcr,如果个个要看引物单子

退火温度与引物的TM值的关系主要和DNA聚合酶与其buffer有关.有些退火温度要比TM低5度、3度,有些还会高3度,有些是一模一样的.主要参考不同公司所生产的DNA聚合酶的说明书.

退火温度与引物的TM值的关系主要和DNA聚合酶与其buffer有关.有些退火温度要比TM低5度、3度,有些还会高3度,有些是一模一样的.主要参考不同公司所生产的DNA聚合酶的说明书.

最好之在理论值附近进行温度梯度实验,理论值用上述两种方法均可获得

还是胶制的不好,因为marker都没跑好的

引物多长?是否覆盖了两段DNA分子?查一查重叠PCR方法吧?难道不能用酶切连接完成两个片段之间的重组吗?

你做的什么PCR?是real-time?EtBr染色的?可能性较大的是,1,非特异性结合,2,形成primerdimer先画个标准曲线吧再问：EB染色啊，目的条带是960BP，每次在500bp左右都会

Tm指的是把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度.我们PCR时候,当然不能用Tm值来作为退火的温度.一般来说,退火温度比Tm值要低上5度左右.但是这个也不是绝对的.建议你如果说模板比较充足的话,做一个梯

软件终归是软件,一个PCR体系的具体反应条件不通过实际运行是无法得知最佳退火温度的.建议你做一个梯度PCR摸索一下最佳退火温度.

就就低不就高,因为温度高了会使低退火温度的引物掉下来,但是低温度不影响高退火温度的引物结合,但有可能会有非特异扩增.58度肯定可以跑出来,结果如何都是要跑胶看一看再作调整.PS：不管引物公司给的退火温

从原理角度分析,在Tm值的温度下,引物只能1半与模板DNA结合,低几度就全结合上去了.PCR扩增时需要引物完全结合到模板上才行.

我用primer5设计出来的Tm值从来都是直接当退火温度用.用引物primer-blast的话我都是直接贴序列上去.有其他菌的匹配很正常,有些进化亲缘性很近的,只要在同一物种中没有匹配上的问题应该不大

博凌科为-为你上下游温度很接近啊,45度,上下5度,0.2每个梯度.或者直接用47度P

引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）.这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的.在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还

第四项,Tm【℃】,三行分别是正义引物,反义引物和PCR产物的退火温度.再问：这我知道，在PCR的时候退火温度应该选哪个？再答：当然是看引物的了。设的时候应该让两条引物Tm值尽量接近，要是没办法选择，

理论上退火温度越低越利于引物和模板结合,但是有时候就是这样的,低的退火做不出来,高的做出来,我也碰到过这样的情况.其实影响PCR扩增的因素远比我们知道的多得多.我的猜测是这样的,可能刚好在这段引物或者

一般认为Tm-5度.但是要看你的Tm计算方法,不同公司合成的引物得出的Tm都不一样,你可以做个梯度PCR看看最适退火温度,以后就有经验了.

390C--420C,保温1-2小时,