巢式PCR需要做内参吗?要是做得话是在第二轮加吗?

看看你的GAPDH引物Tm多少,有可能是因为PCR条件适合目的基因引物对而不适合内参引物对吗?再问：不知道，我是个新手什么都不懂再答：那么童鞋，你还是找一个师兄师姐前辈高人带一下。网上这样问很难问出来

上下引物的Tm最好相似,不能差异太大,不然不好设计退火温度；内参条带很亮,说明RT应该没多大问题,问题可能出现在PCR上.没有目的基因是因为1该基因确实不表达；2你的引物不特意,到NCBI的Prime

朋友,首先跟你说一下我的经验,其实这里有个误区,其实普通PCR对RealtimePCR的指导意义实在是太小,因为realtimePCR的引物跟普通PCR的引物有很大差别,realtimePCR的引物因

可以.定量PCR内参的选择最重要的是这个基因在不同个体之间的此组织（比如是肌肉）表达恒定.所以你需要找好了.

要在生物体或细胞内稳定表达的基因才能作为PCR的内参基因,因此又名看家基因,由于在不同细胞、组织中常量表达,没有组织特异性,因此不同昆虫之间可以共同使用内参.再问：那引物是根据自己的物种去具体设计还是

就是你那样做的.亮的就稀释模板,上样量当然要保持

一般认为一些持家基因的表达量在不同状态下变化不大,所以可以认为它们表达是恒定的,故而用来做内参简而言之,就是你有两个样品（譬如不同生长条件或者不同组织的）,要比较其中某基因A表达转录变化,就分别比较两

1,首先需要根据三个目标基因及Actin的序列设计四对引物,引物设计原则同普通PCR引物,网上有很多介绍的,最好其中一个引物是结构基因部分序列+内含子部分序列这种模式.序列长一些25++,退火温度高一

内参的选择：普通PCR内参的大小没有多大要求,但realtime一般选择300bp以下它的作用在于你提取的RNA逆转录成cDNA时,加入的浓度可能会不一致,即使用分光广度计测其浓度,也会有仪器误差.P

是的,你需要用等量体系分别用每对引物进行PCR.实际操作时,我们要求至少3份biologicreplica,用来检测你所测到的表达变化确实是因为实验组与对照组之间的差别.同时这3份biologicre

啥都没有的话是无法设计的首先你可以克隆获得内参的序列,再进行下一步实验再问：如果是想用18srRNA这个内参，我该怎么设计引物来得到这段序列呢？再答：这个在各个物种中的同源性很高的，你可以直接用其他物

你说的应该是realtimePCR吧,注意RT其实是逆转录reversetranscription的缩写,和realtime一定要分开来.常说的qPCR,qRT-PCR,都是通过实时（realtime

说一下自己做实验时候用到的东西,血液提取mRNA还是采用试剂盒来提取,手工法极不推荐,但是试剂盒还是蛮贵的,可以问一下天根公司,价格还算可意,效果也不错.逆转录过程可以用Fermentas一款逆转录试

这是由你设计的引物决定,一般控制在200bp以下为佳.包括你要检测的目的基因,设计的片段长度也控制在200bp以内.保证扩增效率较为一致.

1.6-kbfragmentencompassingtherp49gene,whichcodesforaribosomalprotein,hasbeenclonedandsequencedinDros

简单呐,主要是设计引物,分为外套引物和内套引物你可以设计单边巢式或者双边巢式的引物,如果内套引物为1和2的话,外套可以设计3和4,或者设计3和1配,或者设计3和2配.打个比方,比如你要扩增的目的基因在

啥叫不同阶段只要模板不同就要检测内参标准曲线是指拿已知浓度的标准品做出来的曲线不是一个概念

对这个是必须的.再问：那每次做的标准曲线的差异怎么去评价呢？差异在什么范围内可以呢？谢谢再答：必须的每次都做做标准！

是做RT－PCR吧?一般来说需要反转录酶、Taq酶,dNTP,缓冲液、引物和各种离子等.

楼上的大哥,我的神啦,内参如果不是用同样退火温度,不是跟被测基因同时p的话,还好叫内参的吗?不过这得怪楼主没有说清楚,RT是反转录还是说realtime的定量PCR啦?如果是反转录的话,好像是叫loa