我在做overlap PCR,两个片段一条736bp,一条255bp,20个重叠碱基,四个引物的TM值都是59度,两条都

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：综合作业时间：2024/05/10 07:51:56

我在做overlap PCR,两个片段一条736bp,一条255bp,20个重叠碱基,四个引物的TM值都是59度,两条都P出来了
现在加入两端的引物,就是扩不出来1000的条带,这20重叠有13个是CG对,我不知道是不是退火温度的原因,54°了都,总之就是两条链不连,

试试把退火时间延长一些,看能不能把两条链连上.一般就是照着引物的Tm值做就可以的.
再问：退火时间是30S，应该足够了，对于退火温度能给个建议吗？我现在不加两端引物，先做Pool，看看能不能连，谢谢你的建议！
再答：退火时间确实不是一个很关键的因素。你两条链的量怎么样？PCR的时候最好两条模板链的加入量差不多，这样容易连上。退火温度，我也试着往下降过，不过没有用，最后也不知道怎么就做出来了。。。。。。
再问：两条链含量相近，55°退火30s，25个循环，现在Pool做出来了，不是很亮，加两端引物扩增后就很亮了，谢谢你的帮助！

我在做overlap PCR,两个片段一条736bp,一条255bp,20个重叠碱基,四个引物的TM值都是59度,两条都 PCR 引物设计,在扩增一个基因片段,1200bp左右,编码区1000个bp左右.由于上游引物GC含量高,我想分两段扩增 PCR引物设计问题如果我设计的引物,扩增出来的目的片段长度为200BP,但是石蜡包埋组织提取出来的DNA模板大多数在10 16S RDNA作为通用引物,用于细菌总DNA 提取后跑PCR,扩增出的片段是多少个bp呢? 双酶切老是切不完全我PCR克隆了一段200bp的基因片段,然后连接到了T载体,引物2端各有EcoRI和HindIII的酶 PCR中,PCV2的引物扩增后,跑电泳的条带在多少bp? realtime PCR 做实时荧光PCR,就用染料的那种,是不是有要求PCR的片段,一般在100BP左右? 请问,我反转录时设置了2个循环,cdna还可以做半定量PCR吗?Actin的pcr在500bp单一条带. 我在做PCR时,有好多的引物,Tm值在40-62之间,不知道用什么温度比较好. 设计的引物19个碱基,其中包括6 bp的酶切位点和3个保护碱基,和模板配对的只有11个碱基,是不是太短? 我做的是双向测序,片段300bp左右.请问怎么在测序结果中找出引物?需不需要把某个片段或序列变方向之类的测序：中间碱基有缺失我在NCBI下载了一段已知基因序列,然后设计引物重复,以外发现有一段缺失,少94个bp,这样后面的编