real-time PCR中内参基因的CT值

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/04/30 14:51:39

real-time PCR中内参基因的CT值
做了几次real-time PCR ,选的18s做内参基因,是直接购买的,所以没有问题,但是测得的CT值在对照组中和实验组中均有误差,相差约0.3左右,想请问这样的误差正常吗?如果不正常,会是什么原因造成的呢?
一直不太懂怎么看内参的值，是不是同一个细胞中的对照组和实验处理组的内参要一致才可以？我的都相差3-4个CT值，该如何校正？

这个要看你在做PCR前的加样量是否一致.如果加样量是一致的,而内参做出来差别大（比如3-4个CT值）那说明你的实验体系有严重的问题.理论上加入的DNA量一样多,内参的CT值应该都一样.如果你能肯定加样量是一致的,那说明你的样本要么降解了,要么就是你的实验处理对内参的量产生了影响,必须换一个基因做内参.还有就是你的加样量误差很大.这样的话,建议你内参和目的基因在一个管子内做.各自选用不同的颜色标记的探针,不用CYBR Green.这样就没有任何加样误差了.
这个所谓的“校正”就是保持每个样本的加样量的一致.
再问：之前用这个实验体系学长做出来过，没有问题，但是RNA的确反复冻融我考虑有这方面因素，但是RNA的降解会使CT值相差如此大吗？如果我重新RNA提取，反转录，接着用CYBR Green做，会不会好一些？
再答： RNA 切记反复冻融。而且我估计你RNA也没有保存在液氮里面。这样的话，几次以后就基本降解了。你可以提出RNA后立刻反转录为cDNA，然后分管冻存，尽量避免反复冻融。cDNA可以保存在-20°，不用液氮。

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