用革兰氏阳性菌做菌落PCR时,怎样处理菌体模板?

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/05/16 00:31:27

用革兰氏阳性菌做菌落PCR时,怎样处理菌体模板?
如题,本人刚刚开始做分子生物学方面的研究,因为大家都知道G+的胞壁比G-菌比如E.coli的要厚些,所以要在PCR之前要对模板进行一定的处理,但是怎样处理才好?我上次做的时候就挑去单菌落（猪链球菌2型）溶30微升水后用95°处理10min,然后取了5微升做模板加到PCR体系里去了,做完PCR跑胶检测的时候没有带,我觉得是我在处理模板的时候没处理好导致的,因为其他试剂都是刚买的,请各位有经验的指点一下我这个新手,步骤最好说的详细一些,

为什么不抽基因组?抽出来的模板你可以用好多次.煮沸法模板有效期短,提取的效率也很低下,干扰PCR的杂质也多.就像你PCR失败一样,不一定是模板中没有DNA,也可能是杂质干扰的结果.
如果样本只是一个菌,或者不是很多,建议少量提取基因组,这样的模板是不会有问题的.至少,包括我在内我所有见过的做过这个实验的人都没有失败过.
如果样本很多,非得要煮沸法的话你这样做：
不要用PCR仪95℃处理,用液体培养基离心获得菌体,除去培养基,无菌水悬浮,沸水浴30min,迅速-20℃冰冻,化冻后8000rpm离心以沉淀细胞碎片,取2μL上清作为PCR模板.
如果你非要用PCR仪处理,也行,37℃溶菌酶预处理30min.
如果我说的你都不想做,那么请把你的模板用量减少到2μL（我指的是对于50μLPCR体系来说）,说不定是杂质太多导致你PCR失败.

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