作业帮设计测量酶抑制剂IC50的实验
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：综合作业 时间：2024/05/30 09:23:53
设计测量酶抑制剂IC50的实验
没有太多生化基础,想设计一个已知对某酶有抑制作用的药物的抑制效果的实验.想比较几个药物的抑制效果大小.IC50,半数抑制浓度常数是很好的一个参数.我设想用一系列不同浓度的药物,包括0浓度对照,加入相同浓度的酶,作用一段时间.然后加入底物.药物和酶结合需要多长时间,我用的是室温条件.我应该加同一浓度的底物还是不同浓度的底物呢?
没有太多生化基础,想设计一个已知对某酶有抑制作用的药物的抑制效果的实验.想比较几个药物的抑制效果大小.IC50,半数抑制浓度常数是很好的一个参数.我设想用一系列不同浓度的药物,包括0浓度对照,加入相同浓度的酶,作用一段时间.然后加入底物.药物和酶结合需要多长时间,我用的是室温条件.我应该加同一浓度的底物还是不同浓度的底物呢?
抑制剂和酶的结合速度要看情况而定,主要和你的抑制剂有关,许多情况下结合得很快,但是也有slow binding inhibitor(我最近做的一个就是,抑制剂和酶的平衡时间很长,中途加根本看不出变化,必须吧抑制剂和酶一起incubate 15分钟,然后用底物引发).
如果只是IC50,一个底物浓度就够了.但是IC50会随底物浓度的变化而变化,所以你要指定一个底物的浓度,发表IC50的时候要注明你底物的浓度.这个浓度如果没有任何依据的随意指定一个,感觉上就会不专业.如果你已经有其它人关于这个酶和其它抑制剂的资料(并且上面详细注明了所用的酶和底物的浓度,还有对底物的Km),你当然可以省事的在其它人的底物浓度下测你的IC50.不过如果你没有详细的相关资料或者不很肯定查到的相关数据,最好是先自己做一下这个酶的动力学曲线.具体怎么做动力学找本书上就有了.简单的就是根据相关资料(新的酶就要看自己的感觉了)设计几个底物浓度,然后调整加的酶的浓度使得所有速度曲线在引发后的几分钟都是线性的,而且前几分钟消耗的底物量一定不要超过底物总浓度的10％.底物的浓度你要高高低低地试几次,然后估算出Km的大致值(加许多底物让酶饱和,这个时候测出的速度应该是Vmax, Km就是使得速度为Vmax一半的时候的底物浓度).然后你设计10～15个底物浓度点上及5倍Km,下及1/5Km,注意Km附近点要密集些因为正是曲线的拐弯处.情况好的话你就会拿到那个酶的Michaelis-Menten曲线(X轴底物浓度Y轴速度),处理后得到Km和Kcat.我觉得最后指定的测IC50的底物浓度要么是Km,要么是3xKm或5xKm(饱和).
当然如果你有决心的话,最好是做个关于抑制剂的全动力学以得出Ki.具体的方法 就是选5～8个底物浓度点,然后在每个底物浓度下测4~6个抑制剂浓度的反应速度,我一般是为保准确每个数据点重复2～3次,工作量不小,但是Ki不受其它因素影响,直接表征抑制剂对酶的结合能力,是适合发表的正式数据
如果只是IC50,一个底物浓度就够了.但是IC50会随底物浓度的变化而变化,所以你要指定一个底物的浓度,发表IC50的时候要注明你底物的浓度.这个浓度如果没有任何依据的随意指定一个,感觉上就会不专业.如果你已经有其它人关于这个酶和其它抑制剂的资料(并且上面详细注明了所用的酶和底物的浓度,还有对底物的Km),你当然可以省事的在其它人的底物浓度下测你的IC50.不过如果你没有详细的相关资料或者不很肯定查到的相关数据,最好是先自己做一下这个酶的动力学曲线.具体怎么做动力学找本书上就有了.简单的就是根据相关资料(新的酶就要看自己的感觉了)设计几个底物浓度,然后调整加的酶的浓度使得所有速度曲线在引发后的几分钟都是线性的,而且前几分钟消耗的底物量一定不要超过底物总浓度的10％.底物的浓度你要高高低低地试几次,然后估算出Km的大致值(加许多底物让酶饱和,这个时候测出的速度应该是Vmax, Km就是使得速度为Vmax一半的时候的底物浓度).然后你设计10～15个底物浓度点上及5倍Km,下及1/5Km,注意Km附近点要密集些因为正是曲线的拐弯处.情况好的话你就会拿到那个酶的Michaelis-Menten曲线(X轴底物浓度Y轴速度),处理后得到Km和Kcat.我觉得最后指定的测IC50的底物浓度要么是Km,要么是3xKm或5xKm(饱和).
当然如果你有决心的话,最好是做个关于抑制剂的全动力学以得出Ki.具体的方法 就是选5～8个底物浓度点,然后在每个底物浓度下测4~6个抑制剂浓度的反应速度,我一般是为保准确每个数据点重复2～3次,工作量不小,但是Ki不受其它因素影响,直接表征抑制剂对酶的结合能力,是适合发表的正式数据