作业帮做荧光定量PCR,前期提取RNA的时候一定要加入DNase I和RNase inhibitor吗?我这次提取的RNA,O
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：生物作业 时间：2024/04/29 11:26:50
做荧光定量PCR,前期提取RNA的时候一定要加入DNase I和RNase inhibitor吗?我这次提取的RNA,OD260/280是1.88,跑出的条带还行.现在应经反转录为cDNA了,不知道做后期的荧光定量PCR有影响没?
1.其实反转录要求不是很高,所有器具消毒操作带手套口罩就行,没必要加RNaseInhibitor
2.OD260/280实际上反应的是蛋白质杂质的比例,可以间接的反应有没有RNA酶污染,所以这个比值低了有可能是RNA酶污染,也可能是提取操作或者试剂问题导致蛋白质残留过多.
做普通跑胶比值要求高一些在1.80-2.20之间；如果做实时定量要求就会低很多,1.5我都做过,影响不是很大,总量少不怕,就怕有差异,关键是点样不容易均一,因为实时定量非常敏感,很小的差异都会放大N倍,一般就靠增大总反应体积来减少误差,30-50微升的时候由操作带来的误差会大大减少,而很多人用的10微升体系做10次能有2次正常结果就不错了.
2.OD260/280实际上反应的是蛋白质杂质的比例,可以间接的反应有没有RNA酶污染,所以这个比值低了有可能是RNA酶污染,也可能是提取操作或者试剂问题导致蛋白质残留过多.
做普通跑胶比值要求高一些在1.80-2.20之间；如果做实时定量要求就会低很多,1.5我都做过,影响不是很大,总量少不怕,就怕有差异,关键是点样不容易均一,因为实时定量非常敏感,很小的差异都会放大N倍,一般就靠增大总反应体积来减少误差,30-50微升的时候由操作带来的误差会大大减少,而很多人用的10微升体系做10次能有2次正常结果就不错了.
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