作业帮一道关于基因工程（干扰素在大肠杆菌中表达）的问题，跪求答案
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：综合作业 时间：2024/05/10 11:02:19
一道关于基因工程（干扰素在大肠杆菌中表达）的问题，跪求答案
在人类干扰素基因中编码精氨酸的高频密码子为AGA和AGG，但是在大肠杆菌中这两个密码子的使用频率很低，而且当两个密码子串联连续出现时, 与天然的SD序列AAGGAGGU近似, 竞争与SD结合, 会造成外源基因表达错误或提前终止。hIFN-α2b的开放读码框中就含有4个AGG、3个AGA,其中就含有AGGAGG和AGGAGA这样连续出现的稀有密码子。
hIFN-α2b基因长度512bp。序列内部含有 BamHI、PstI、SacI、HindIII酶切位点，待选用的大肠杆菌表达载体pDH启动子之后的克隆位点有EcoRI、PstI、HindIII、SaLI。
问题：
①、若想在大肠杆菌中表达人类干扰素基因如何避免因稀有密码子使用造成的表达效率下降问题？
②、如何将hIFN-α2b重组入pDH？重组DNA 如何转化大肠杆菌，转化后如何鉴定阳性克隆？
③、假若表达出来的蛋白以包涵体形式存在，应该如何回收蛋白，并恢复蛋白活性？
④、如何采用WESTERN BLOT的方法检测分离到的蛋白是否是hIFN-α2b？
⑤、如何鉴定经分离纯化并复性的蛋白的抗病毒活性？
跪求答案，在线等待～
在人类干扰素基因中编码精氨酸的高频密码子为AGA和AGG，但是在大肠杆菌中这两个密码子的使用频率很低，而且当两个密码子串联连续出现时, 与天然的SD序列AAGGAGGU近似, 竞争与SD结合, 会造成外源基因表达错误或提前终止。hIFN-α2b的开放读码框中就含有4个AGG、3个AGA,其中就含有AGGAGG和AGGAGA这样连续出现的稀有密码子。
hIFN-α2b基因长度512bp。序列内部含有 BamHI、PstI、SacI、HindIII酶切位点，待选用的大肠杆菌表达载体pDH启动子之后的克隆位点有EcoRI、PstI、HindIII、SaLI。
问题：
①、若想在大肠杆菌中表达人类干扰素基因如何避免因稀有密码子使用造成的表达效率下降问题？
②、如何将hIFN-α2b重组入pDH？重组DNA 如何转化大肠杆菌，转化后如何鉴定阳性克隆？
③、假若表达出来的蛋白以包涵体形式存在，应该如何回收蛋白，并恢复蛋白活性？
④、如何采用WESTERN BLOT的方法检测分离到的蛋白是否是hIFN-α2b？
⑤、如何鉴定经分离纯化并复性的蛋白的抗病毒活性？
跪求答案，在线等待～
①
1、优化表达载体设计；
a、启动转录起始的启动子序列
b、决定mRNA翻译的SD序列的优化
2、提高稀有密码子tRNA的表达作用；
如：Pro、CCG、CCC、CCU和CCA
3、提高干扰素基因mRNA的稳定性；
a、减少核酸外切酶可能对干扰素基因的切割作用
b、改变干扰素基因mRNA的结构，使之不易被降解
4、提高干扰素基因表达产物的稳定性；
a、使用蛋白水解酶缺陷宿主
b、分泌型载体
c、对外源蛋白中水解酶敏感序列修饰和改造
d、融合蛋白
5、优化发酵过程。
可以使用化学合成法，使用大肠杆菌偏爱密码子编码精氨酸（CGT）及其他氨基酸，避免对翻译的干扰。合成后使用PCR扩增得到大量目的基因。
在化学合成过程中，使用短片段直接连接法。先将化学合成的一条寡核苷酸片段激活，使其带上5′-磷酸基因，然后再与另一条部分互补的寡核苷酸片段退火，形成带有黏性末端的双链寡核苷酸片段。 把这些双链寡核苷酸片段混合在一个试管中，加上T4DNA连接酶，使它们彼此连接组装成一个完整的基因或基因的一个片段。
化学合成主要是可以任意制造、修饰基因，在基因两端方便地设立各种接头以及选择各种宿主生物偏爱的密码子。但合成的基因可能存在表达方面的困难，例如误选了低频率使用的密码子或由于遗传密码的简并性等原因；且价格因素限制一时难以改变。
②
1、PCR引物两端设计突出的酶切位点；
在PCR引物两端设计突出的酶切位点，使扩增产物两端分别添加上EcoRI 、SaLI（如果配有载体的图，选离得远的两个酶切位点）酶切位点，注意方向性，注意添加保护碱基。
2、双酶切后连接载体和目的基因；
a、PCR产物双酶切回收
b、载体同样酶双酶切回收
c、混合后加入DNA连接酶连接
d、连接后电泳回收目的桥带得到重组子
3、转化；
制备大肠杆菌感受态细胞（氯化钙诱导重组子转化感受态细胞）
4、鉴定。
酶切鉴定筛选出阳性克隆
③
以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，形成包涵体．包涵体有利于防止蛋白酶对表达蛋白的降解，并且也有利于分离表达产物，其水难溶性及密度远大于其它细胞碎片和细胞成分。但包涵体形成后，表达蛋白不具生物活性。
回收：
收集菌体，悬于缓冲液中超声破碎菌体，在适当的溶液中分级离心取沉淀即可得到包涵体；
洗涤沉淀后，层析可得到纯化包涵体。
复性：
尿素溶液使包涵体充分变性溶解，谷胱甘肽复性使蛋白折叠成天然构象复性，其关键在于如何使二硫键正确配对。
④
提取总蛋白
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；
蛋白印迹：半干法将蛋白条带电转印至PVDF膜上；
探针制备：以山羊抗hIFN-α2b多克隆抗体作一抗，以HRP 标记的兔抗山羊IgG作二抗；
杂交和检测。
⑤
在96孔板培养细胞，分别加入梯度稀释的蛋白溶液培养，再加入病毒液攻击，注意空白对照和活性对照，共培养一段时间后观察细胞病变情况判断蛋白生物学活性。
1、优化表达载体设计；
a、启动转录起始的启动子序列
b、决定mRNA翻译的SD序列的优化
2、提高稀有密码子tRNA的表达作用；
如：Pro、CCG、CCC、CCU和CCA
3、提高干扰素基因mRNA的稳定性；
a、减少核酸外切酶可能对干扰素基因的切割作用
b、改变干扰素基因mRNA的结构，使之不易被降解
4、提高干扰素基因表达产物的稳定性；
a、使用蛋白水解酶缺陷宿主
b、分泌型载体
c、对外源蛋白中水解酶敏感序列修饰和改造
d、融合蛋白
5、优化发酵过程。
可以使用化学合成法，使用大肠杆菌偏爱密码子编码精氨酸（CGT）及其他氨基酸，避免对翻译的干扰。合成后使用PCR扩增得到大量目的基因。
在化学合成过程中，使用短片段直接连接法。先将化学合成的一条寡核苷酸片段激活，使其带上5′-磷酸基因，然后再与另一条部分互补的寡核苷酸片段退火，形成带有黏性末端的双链寡核苷酸片段。 把这些双链寡核苷酸片段混合在一个试管中，加上T4DNA连接酶，使它们彼此连接组装成一个完整的基因或基因的一个片段。
化学合成主要是可以任意制造、修饰基因，在基因两端方便地设立各种接头以及选择各种宿主生物偏爱的密码子。但合成的基因可能存在表达方面的困难，例如误选了低频率使用的密码子或由于遗传密码的简并性等原因；且价格因素限制一时难以改变。
②
1、PCR引物两端设计突出的酶切位点；
在PCR引物两端设计突出的酶切位点，使扩增产物两端分别添加上EcoRI 、SaLI（如果配有载体的图，选离得远的两个酶切位点）酶切位点，注意方向性，注意添加保护碱基。
2、双酶切后连接载体和目的基因；
a、PCR产物双酶切回收
b、载体同样酶双酶切回收
c、混合后加入DNA连接酶连接
d、连接后电泳回收目的桥带得到重组子
3、转化；
制备大肠杆菌感受态细胞（氯化钙诱导重组子转化感受态细胞）
4、鉴定。
酶切鉴定筛选出阳性克隆
③
以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，形成包涵体．包涵体有利于防止蛋白酶对表达蛋白的降解，并且也有利于分离表达产物，其水难溶性及密度远大于其它细胞碎片和细胞成分。但包涵体形成后，表达蛋白不具生物活性。
回收：
收集菌体，悬于缓冲液中超声破碎菌体，在适当的溶液中分级离心取沉淀即可得到包涵体；
洗涤沉淀后，层析可得到纯化包涵体。
复性：
尿素溶液使包涵体充分变性溶解，谷胱甘肽复性使蛋白折叠成天然构象复性，其关键在于如何使二硫键正确配对。
④
提取总蛋白
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；
蛋白印迹：半干法将蛋白条带电转印至PVDF膜上；
探针制备：以山羊抗hIFN-α2b多克隆抗体作一抗，以HRP 标记的兔抗山羊IgG作二抗；
杂交和检测。
⑤
在96孔板培养细胞，分别加入梯度稀释的蛋白溶液培养，再加入病毒液攻击，注意空白对照和活性对照，共培养一段时间后观察细胞病变情况判断蛋白生物学活性。
一道关于基因工程（干扰素在大肠杆菌中表达）的问题，跪求答案
一道基因工程的题目科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组,并成功地在大肠杆菌中得以表达.但在进行基因工程
人的干扰素基因能在大肠杆菌内表达,其根本原因
选修三里讲干扰素是一种糖蛋白,又说用基因工程方法可在细菌培养物中得到,(大肠杆菌),不过细菌体内连内质网都没有,要怎么糖
关于基因工程中质粒的表达作用
【高中生物】基因工程的问题[将人的胰岛素基因转移到大肠杆菌中成功表达后,可获取大量的人胰岛素.]
基因工程实验设计题设计一个实验：使植物水通道蛋白基因在大肠杆菌中表达设计一个实验：让猪的生长激素基因在大肠杆菌中表达设计
罗曼鸡的大肠杆菌病如何治疗 大肠杆菌在适宜的环境中求答案
科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组,并成功地在大肠杆菌中得以表达.但在进行基因工程的操作过程中,需使
酵母菌与大肠杆菌的区别 特别是在基因工程中他们做受体细胞
（2008•珠海模拟）干扰素是能够抑制多种病毒复制的抗病毒物质．科学家利用基因工程技术从人的T淋巴细胞中提取干扰素基因转
科学家运用基因工程技术将人的胰岛素基因与大肠杆菌的质粒DNA分子重组，并且在大肠杆菌体内获得成功表达.如图所示a处为胰岛