作业帮PCR克隆出来的基因怎么确定是我想要的
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：生物作业 时间：2024/05/15 16:11:58
PCR克隆出来的基因怎么确定是我想要的
假设我知道,人的某段基因和老鼠的某段基因很相似,我用PCR的方式来克隆人的这段基因,因为我事先已经知道了老鼠的这段基因的序列,所以我可以设计出引物.但是,我最后得到了PCR的产物,我怎么确保我克隆出来的这段产物基因和老鼠的那段基因是一样的序列呢?
假设我知道,人的某段基因和老鼠的某段基因很相似,我用PCR的方式来克隆人的这段基因,因为我事先已经知道了老鼠的这段基因的序列,所以我可以设计出引物.但是,我最后得到了PCR的产物,我怎么确保我克隆出来的这段产物基因和老鼠的那段基因是一样的序列呢?
将PCR产物凝胶电泳,切割回收DNA长度近似的条带（凝胶回收）,将回收提纯的DNA克隆至质粒载体（先酶切再连接）,将载体转化至细菌扩增,提取质粒,利用质粒上已知序列作为因为对目的DNA测序,利用Blast比对测序产物与老鼠基因的近似性.这是基因工程的一般通用步骤.
回答你问上面的问题,你可能没有真正接触过分子方向的实验,你说的荧光标记在理论上可行,但是成本太高,而且探针只能测定部分序列,无法对DNA全序列进行比对,综合成本及效率,测序最为省力.当然,你也可以用酶切做一个基本判断,如果基因的同源性很高,可以不用测序.
再问： 您说对了TAT我的确是刚学这个，刚接触一点生物技术的东西OTL
再答： 一般来说，如果基因同源性很高，如此例中人与小鼠的基因，如果PCR扩增出来的条带大小与你预计的长度相等，基本就可以判断是目的基因了，甚至可以不用做测序。因为PCR引物和反应条件本来特异性就比较高，如果扩增出的片段又和预期长度相等，会是其他基因的概率很小。顺便回答楼下的问题，提取PCR产物，一般使用试剂盒从凝胶提纯，可以从各种试剂公司购买到，在google输入PCR产物纯化试剂盒即可。还有，楼下那位朋友说直接将PCR产物提纯不转入质粒就送去测序的问题，基本属于扯淡千万别信，原因有2，第一凝胶回收不经过质粒扩增纯度还是很差，测序效果绝对不好。第二更加关键，因为DNA测序都只能从你引物下游近100bp后才可以得到结果，如果直接测序，意味着你基因头尾近200bp的序列无法探测，一旦你的基因有不同的splicing form，你根本无法通过测序得知，这很可怕。
回答你问上面的问题,你可能没有真正接触过分子方向的实验,你说的荧光标记在理论上可行,但是成本太高,而且探针只能测定部分序列,无法对DNA全序列进行比对,综合成本及效率,测序最为省力.当然,你也可以用酶切做一个基本判断,如果基因的同源性很高,可以不用测序.
再问： 您说对了TAT我的确是刚学这个，刚接触一点生物技术的东西OTL
再答： 一般来说，如果基因同源性很高，如此例中人与小鼠的基因，如果PCR扩增出来的条带大小与你预计的长度相等，基本就可以判断是目的基因了，甚至可以不用做测序。因为PCR引物和反应条件本来特异性就比较高，如果扩增出的片段又和预期长度相等，会是其他基因的概率很小。顺便回答楼下的问题，提取PCR产物，一般使用试剂盒从凝胶提纯，可以从各种试剂公司购买到，在google输入PCR产物纯化试剂盒即可。还有，楼下那位朋友说直接将PCR产物提纯不转入质粒就送去测序的问题，基本属于扯淡千万别信，原因有2，第一凝胶回收不经过质粒扩增纯度还是很差，测序效果绝对不好。第二更加关键，因为DNA测序都只能从你引物下游近100bp后才可以得到结果，如果直接测序，意味着你基因头尾近200bp的序列无法探测，一旦你的基因有不同的splicing form，你根本无法通过测序得知，这很可怕。