作业帮重组质粒鉴定pcr没条带,酶切有条带
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：综合作业 时间：2024/06/06 08:29:02
重组质粒鉴定pcr没条带,酶切有条带
我有两种重组质粒,两个基因片段大小一样,我的重组质粒都与空质粒大小相差300左右,但是用0.9%的胶140v电泳,无法区分大小,重组质粒进行双酶切,都出现了疑是阳性（条带亮度弱,但清楚）的目的大小的条带,但第一种pcr鉴定时没有目的条带,阴性对照（以空质粒为模板）没有条带；第二种pcr鉴定时有目的基因大小的条带,但阴性对照也有.
请各位老师不吝指教,pcr鉴定的可行度高吗,有没有测序的必要,还是重新做?
谢谢
我有两种重组质粒,两个基因片段大小一样,我的重组质粒都与空质粒大小相差300左右,但是用0.9%的胶140v电泳,无法区分大小,重组质粒进行双酶切,都出现了疑是阳性（条带亮度弱,但清楚）的目的大小的条带,但第一种pcr鉴定时没有目的条带,阴性对照（以空质粒为模板）没有条带；第二种pcr鉴定时有目的基因大小的条带,但阴性对照也有.
请各位老师不吝指教,pcr鉴定的可行度高吗,有没有测序的必要,还是重新做?
谢谢
pcr的鉴定可信度还是比较高的,当然这是针对确认的结果来说,也就是说通过pcr已经确证了,再去测序,以排除可能性较小的假阳性和克隆过程中产生的突变.
你现在是pcr的问题还没有解决,连阴性都有条带,应该先把pcr的问题解决了.我觉得先要确定你的引物有没有问题?你的阴性对照是否真的“阴性”?是不是pcr体系有污染了,比如水和buffer?等
总之pcr通过了再测序,pcr没通过默认克隆没有成功
再问： 谢谢您！ 但是为了验证我的引物没有问题，我将模板用去离子谁代替，同样体系、参数进行了pcr，没有条带，那我是不是可以认为我的引物没有问题呢？ 有没有可能是由于pcr的影响因素太多了呢，比如说：我用CDNApcr出目的基因的体系，参数并不适用于重组质粒的pcr鉴定呢。我今天又进行了双酶切鉴定又有目的基因大小的条带，能不能说明连上了呢，
再答： 确实影响pcr结果的因素有很多,所以影响因素要一个个排除,就像控制变量法一样。如果你的引物曾扩增成功过，并阴性对照是没条带的，那应该没问题。酶切也有条带说明至少有东西连进去了，你再看看多克隆位点的图是不是会有问题。有时taq酶也有可能出问题，你换一下酶，或去别人的实验室做一下等等。pcr再降低一点退火温度试试
你现在是pcr的问题还没有解决,连阴性都有条带,应该先把pcr的问题解决了.我觉得先要确定你的引物有没有问题?你的阴性对照是否真的“阴性”?是不是pcr体系有污染了,比如水和buffer?等
总之pcr通过了再测序,pcr没通过默认克隆没有成功
再问： 谢谢您！ 但是为了验证我的引物没有问题，我将模板用去离子谁代替，同样体系、参数进行了pcr，没有条带，那我是不是可以认为我的引物没有问题呢？ 有没有可能是由于pcr的影响因素太多了呢，比如说：我用CDNApcr出目的基因的体系，参数并不适用于重组质粒的pcr鉴定呢。我今天又进行了双酶切鉴定又有目的基因大小的条带，能不能说明连上了呢，
再答： 确实影响pcr结果的因素有很多,所以影响因素要一个个排除,就像控制变量法一样。如果你的引物曾扩增成功过，并阴性对照是没条带的，那应该没问题。酶切也有条带说明至少有东西连进去了，你再看看多克隆位点的图是不是会有问题。有时taq酶也有可能出问题，你换一下酶，或去别人的实验室做一下等等。pcr再降低一点退火温度试试