做定点突变PCR时,如果模板加多了,会怎么样?

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/05/10 07:30:25

做定点突变PCR时,如果模板加多了,会怎么样?
说明书上要求的是100ng,加了1μl,后来发现浓度是150ng/μl,这会对后续的实验有何影响?

模板多加,最大的影响就是DpnI消解模板的时候容易消解不完全,这个可以从阴性对照的平板上涨了多少菌落看出来,（阴性对照就是可实验组加同样多的模板,以及buffer和酶等等,只是不加引物,最好一起PCR,一起Dpn I消解,一起转化）.
最佳的肯定是阴性的板子一个都没长,也就说明你实验组的板子上长出来的全部是突变成功的,如果消解不完全,就看阴性的平板上菌落多不多(模板是超螺旋质粒,突变的质粒是带缺刻的,转化效率不及超螺旋状态的质粒),要是相比你实验组板子上菌落数微不足道,那也没关系,挑两个去测序,运气没那么背.
现在你是模板多加了一点,那其实完全可以在后续的步骤中补救；比如你做了25μl体系的突变PCR,那么除去取5-10μl跑个电泳确认突变引物P成功了,剩下的15μl你可以少取点(比如5μl)进行DpnI消解,并且可以增加DpnI酶的用量和反应时间,这些都可以增加完全消解模板的几率.

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