再设计引物时,添加酶切位点和标签后,正反两个引物相差20个碱基,但在添加前相差不大,

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/05/18 20:41:46

标签是指的表达标签么?如果是表达标签的话,载体上没有么?通常表达标签不是通过引物引入的,而是载体本来带有的,这个需要确认一下.
另外,引物的使用主要是看Tm值的差异,如果设计后,两条引物的Tm值相差过大,是不能够使用的,因为在退火时,找不到合适的退火温度.因此不能简单通过长短进行判断,需要根据两条的Tm值比较.一般引物设计软件上都有,如果相差太大,没法用.
另外,引物的长度也是有一定的限制的,20-35的长度比较理想,过长和过短都会个扩增带来麻烦,限制相差就差了20个,感觉有条引物太长了.确认下,标签是不是一定要带在上面.
再问：恩，表达载体上没有，Tm相差应该在什么范围内呢？
再答：以前自己设计的时候，都是尽量控制在5C以内。不过有的时候确实很难满足要求，如果一端引物太长了，另一端的引物为了配合也要相应延长的。20个bp没法补过来。如果设计完，一条引物Tm值是70多，另一条只有40，PCR就得靠运气了。或者是买那种扩增能力和抗干扰能力都比较强的酶来做。你看看现在软件上给出的评分怎么样。有时候还是得通过PCR才能判断引物到底合不合适。尤其这样要加入比较长的序列的。先试试看。

有关PCR引物设计好像引物设计好以后,还要添加什么保护碱基,有时还要添加酶切位点,这些东西添加进去后,不是无法和模板链连为什么pcr 引物设计出来,下游引物加上酶切位点和保护碱基后,有一个Tm值是负值呀? 引物设计时如何添加酶切位点我的引物该如何选择?我要设计兼并引物,但是两个最佳位置处的引物Tm值相差较大,而且有二聚体和发卡结构,其余的位置兼并位点设计的引物19个碱基,其中包括6 bp的酶切位点和3个保护碱基,和模板配对的只有11个碱基,是不是太短? PCR扩增目标基因,完全没有条带.是不是设计的引物太短?引物只有10个碱基和模板配对设计引物扩增模板基因,引物中至少要有多少个碱基与模板配对?16个可以吗什么是前引物,后引物为什么引物还分前后?是不是双链打开后一个引物在一条链的3'端另一个在5'端，一前一后? PCR中两个引物的Tm值相差太大有什么害处? PCR时引物的概念包括加进去的酶切位点和保护碱基嘛? 引物的设计原则引物设计原则和具体步骤!原理! 我在做overlap PCR,两个片段一条736bp,一条255bp,20个重叠碱基,四个引物的TM值都是59度,两条都