作业帮请教线粒体提取的几个问题
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：生物作业 时间：2024/06/04 14:46:27
请教线粒体提取的几个问题
1、做液闪仪测心肌细胞线粒体ANT转运酶活性检测,请问有没有非超声破膜的方法（没超声破碎仪）?2、若提得线粒体,如何看它有没有活性呢,用詹那绿B 就可以么?3、液闪仪大概需要多少样本量?
1、做液闪仪测心肌细胞线粒体ANT转运酶活性检测,请问有没有非超声破膜的方法（没超声破碎仪）?2、若提得线粒体,如何看它有没有活性呢,用詹那绿B 就可以么?3、液闪仪大概需要多少样本量?
博凌科为提取新鲜心肌组织细胞内线粒体的方案：1、心肌组织切碎后在4 ℃介质（0.25 mol/L蔗糖、10 mmol/L Tris-HCl pH7.4,0-4℃）中制备心肌组织匀浆.匀浆经750g、离心10 min后留上清,以9000 g离心20 min 后留沉淀,重新悬浮后以9000 g再离心20 min,弃上清得线粒体.全部操作于4 ℃进行.2、培养细胞提取线粒体.细胞弃去培养液后,用细胞收集液作用2到3 min,用scraper,将细胞收集起来,6000 g离心15 min.弃上清,之后加细胞匀浆液,用匀浆器或手动匀浆管匀浆,将装有匀浆液的离心管配平后放入普通离心机,以2500 rpm,离心15 min,缓缓取上清液,移入高速离心管中,保存于有冰块的烧杯中.以17000 rpm离心20 min,弃上清,留取沉淀物.加入0．25mol/L蔗糖与0．003 mol/L氯化钙液l ml,用吸管吹打成悬液,以17000 rpm离心20 min,将上清吸入另一试管中,留取沉淀物,加入0.1ml 0．25mol/L蔗糖与0.003mol/L氯化钙溶液混匀成悬液.即得线粒体.简单的鉴定人线粒体的方法:1、形态法辨别取你用试剂盒提取最后一步的上清液和沉淀物悬液,分别滴一滴于干净载玻片上,标记涂片,各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟.油镜 下观察,颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色.2、PCR法抽提你提取的线粒体DNA.人线粒体基因由16569个碱基对组成.基因组含有37个基因,其中13个为蛋白质基因.2个为rRNA基因,还有22 个tNRA基因.可以选择扩增其中编码电子传递链酶复合体中的亚基基因进行辨别.3、利用单抗进行标记检测线粒体外膜的标记酶为单胺氧化酶,用单胺氧化酶单克隆抗体进行反应后上流式细胞仪进行检测.4、电镜下观察（有条件的话上电镜进行观察恐怕是最直接的了）我个人认为如果你的课题必须鉴定线粒体的完整性,或必须使用较完整的线粒体,那么最好还是上电镜,因为其他方法都是间接证明你的提取物是线粒体.最后液闪仪我没有用过,不过我觉得提取的线粒体数目应该足够你做(每个心肌细胞中都有1000个的线粒体).具体的上样标准我觉得需要查你 使用的液闪仪的说明书.