转基因为什么不能直接用PCR产物连接在表达载体上?

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/05/13 02:57:44

转基因为什么不能直接用PCR产物连接在表达载体上?
我在做小麦转基因到拟南芥中,今天在想为什么不能把目标基因PCR后直接表达载体构建,而要用克隆载体后再构建表达载体?

当然是可以直接将目标基因PCR后直接连到表达载体上的.但实际上在操作过程中,我们都是推荐先将目标基因的PCR产物连接到克隆载体上后再用于构建表达载体.原因是首先如果是未知序列的话,需要用克隆载体来对这段序列进行测定,然后好确定序列中的酶切位点,为下一步表达载体的构建策略提供必要的信息.然后,即使是序列很确定的基因,一般也会先装在克隆载体上.主要是因为你没办法保证你的序列的重复性.如果直接用PCR产物的话,由于你的模板并不一定是完全一致的,即使有少量的mRNA有碱基错配,很有可能就在PCR反应中这些错误的mRNA反转录的cDNA就被无限放大了,这样你连上去的序列就不一定准确了.但如果是装入克隆载体的序列,从克隆载体上获得的序列就有绝对的一致性,这样结果才有说服性.最后一点就是,连在克隆载体上的片段是很稳定的,你以后进行实验的时候还能保证可以获得完全一致的片段.但如果重新RT-PCR,这结果就有几率不同了.当然,对于已知序列直接PCR产物连接表达载体是很少几率出错的,这样做实际上是为了实验结果的严谨.

为什么pcr扩增后不直接进入表达载体,而要经过克隆载体呢?关键原因是什么呢? 能不能用PCR直接扩增目的片段,然后转入表达载体,代替在克隆载体或dh5a中的扩增为什么真核表达载体不能在原核中表达? 如果PCR产物可以直接用来测序,但为什么还需要买PCR产物纯化试剂盒,还要进行连接转化提质粒酶切? 用TAIL-PCR扩增转基因的侧翼序列,从两端扩结果都是载体上的序列 RT-PCR出一段目的基因,为什么要把它先TA克隆呢?为什么不能直接把它连接到相应的质粒上呢为什么目的基因不能直接插入载体? 进行PCR扩增时为什么要将目的基因连到载体上?直接对其进行扩增不行吗? 如何确保pcr产物以正确的方向克隆到表达载体中 (未翻译方向) 基因工程为何要先构建克隆载体然后后构建表达载体能否在获得cDNA后直接连到表达载体上 PCR产物可以直接测序吗 PCR产物测序问题用PCR产物直接测序,PCR产物是1200bp左右,但是测出来只有1000bp,请问为什么少了这么多序