mRNA反转录中使用olig（t）18做引物所得到的是单链cDNA吗?如果是的话如何才能得到双链的cDNA啊?

mRNA反转录中使用olig（t）18做引物所得到的是单链cDNA吗?如果是的话如何才能得到双链的cDNA啊?
再麻烦各位大虾们，反转录所得的cDNA为什么不能用琼脂糖凝胶加EB溶液进行直接检测呢？既然RNA和DNA都可以做到的？

是的,是单链.
想获得双链,请看如下：
为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA即complementary DNA之缩写,或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA双链.与RNA链互补的单链DNA,以其RNA为模板,在适当引物的存在下,由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成,并且在合成单链cDNA后,在用碱处理除去与其对应的RNA以后,以单链cDNA为模板,由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚合酶的作用合成双链cDNA.真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA,在遗传工程方面广为应用.在这种情况下,mRNA的cDNA,与原来基因的DNA（基因组DNA,genomic DNA）不同而无内含子；相反地对应于在原来基因中没有的而在mRNA存在的3′末端的多A序列等的核苷序列上,与exon序列、先导序列以及后续序列等一起反映出mRNA结构.cDNA同样可以被克隆.
详解
一).构建cDNA文库：
以生物细胞的总 mRNA 为模板,用逆转录酶合成互补的双链 cDNA ,然后接到载体上,转入到宿主后建立的基因文库就是 cDNA 文库.
1、mRNA的提取及其完整性的确定
1） 总 RNA 的提取
RNA 提取方法：APGC法或NP-40或应用试剂盒提取总RNA
2）mRNA 的分离
高等真核生物 mRNA 分子的 3' 端均有 poly(A) 尾,将总RNA通过寡聚（DT）纤维柱分离mRNA或利用磁珠法制备纯mRNA.在某些情况下,裂解细胞后用蔗糖梯度来制备mRNA-核糖体复合物作为提取mRNA的替换途径.
3）mRNA 的纯化 ①按照大小对总 mRNA 进行分级,主要用琼脂糖凝胶电泳和蔗糖密度梯度离心法进行分级；②多聚核糖体的免疫学纯化法,这是利用抗体来纯化合成目的多肽的方法.
4）mRNA 完整性的确定
确定 mRNA 完整性的方法有三种：
① 直接检测 mRNA 分子的大小；
② 测定 mRNA 的转译能力；
③ 检测总 mRNA 指导合成 cDNA 第一链长分子的能力.
2、 cDNA 的合成和克隆
1） cDNA 第一链的合成
用亲和层析法得到 mRNA 后,根据 mRNA 分子的 3' 端有 poly (A) 尾结构的原理,用 12~20 个核苷酸长的 oligo （ dT ）与纯化的 mRNA 混合,oligo （ dT ）会与 poly (A) 结合作为反转录酶的引物,反转录反应的产物是一条 RNA-DNA 的杂交链.oligo （ dT ）结合在 mRNA 的 3' 端,因此合成全长的 cDNA 需要反转录酶从 mRNA 分子的一端移动到另一端,有时这种全合成难以达到,尤其是 mRNA 链很长时,为此建立了一种随机引物法合成 cDNA .随机引物是一种长度为 10 个核苷酸,由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段.与 oligo （ dT ）仅与 mRNA 3' 端结合不同,它们可以在 mRNA 的不同位点结合.随机引物法合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体.把 cDNA 克隆到载体中之前,必须把这种杂交体中的 RNA 转变成 DNA 链,即形成双链 DNA 分子.
2）.双链 cDNA 的合成
合成 cDNA 第二条链有两种方法.一种方法是利用 cDNA 第一链的 3' 末端常常出现发夹环的特征,这种发夹结构是反转录酶在第一链末端“返折”并且进行复制第一链的结果,它为合成 cDNA 第二链提供了有用的引物.用这种方法合成的双链 cDNA 在一端有一个发夹环,可以用单链特异的 S1 核酸酶切去.但是 S1 核酸酶的处理,常常会“修剪 ” 过多的 cDNA 顺序,使 cDNA 丢失了 mRNA 5' 端的部分顺序.另一种方法是用大肠杆菌的 RNase H 进行修饰.RNase H 能识别 RNA-DNA 杂交分子并把其中的 RNA 切割成短的片段,这些 RNA 短片段仍与 cDNA 第一链结合,可被新合成的 DNA 所取代.新合成的 DNA 存在切口,用 DNA 连接酶把这些切口连接在一起形成一条完整的 DNA 链.RNase H 法优于 S1 核酸酶法,它能获得包括 mRNA 5' 端全部或绝大部分的更长顺序 cDNA 分子.
3） 将 cDNA 重组到载体上 合成的 cDNA 与载体 DNA 进行连接一般有 3 种方法：
① 借助于末端转移酶的 3' -OH 端合成均聚物的能力,双链 cDNA 和线性化载体 DNA 的 3' -OH 端分别加上均聚核苷酸链；
② 双链 cDNA 和线性化载体 DNA 分别用 Klenow 片段进行末端补平,然后用 T4 DNA 连接酶进行齐头连接,形成重组体；
③ 通过粘性末端连接.
4）.转化
重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株.当不同重组的 DNA 含有不同的 cDNA 基因时,整个转化子含有来自 mRNA 群体的各种 cDNA 基因,这样的转 化子群体构成该 mRNA 全部遗传信息的 cDNA 基因文库.
5）.目的 cDNA 克隆的鉴定
用于从 cDNA 文库中筛选和鉴定目的 cDNA 的方法主要有 3 种：
① 核酸杂交 ② 免疫学杂交检测 ③ cDNA 同胞选择
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反转录的cDNA,你怎么检测?
因为,反转录的cDNA分子量大小不一.mRNA都是成熟的mRNA,由不同的基因转录而来,长度不一.一个细胞内的mRNA的分子量大小,又不是都一样.电泳,跑出来的条带,参差不齐,弥散状.
RNA和DNA能跑电泳,是因为他们的分子量恒定,能跑出特定的条带.