生物化学实验紫外法测定蛋白质含量中哪些不良操作会对实验结果产生影响

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/05/18 19:47:56

实验二、紫外分光光度法测定蛋白质含量
【实验目的】
1.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理和方法
2.掌握紫外光分光光度计使用
【实验原理】
蛋白质中含有酪氨酸、色氨酸等氨基酸残基,在紫外光280nm波长处有最大吸收峰,故可用280nm的光吸收值（即光密度的大小）来测定蛋白质的含量.
由于核酸在280nm也有光吸收,对蛋白质的测定有干扰作用.但核酸的最大吸收峰在260nm,如同时测定260nm的光吸收,通过计算可以消除其对蛋白质测定的影响,因此溶液中存在核酸时,必须同时测定280nm和260nm的光密度,方向通过计算测得溶液中的蛋白质浓度.
【实验操作】
1、稀释血清（或其他蛋白质溶液）,准确吸取0.1mL血清,置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度（即500倍）.
2、测定光密度在紫外分光光度计上,将稀释的蛋白质溶液倒入石英比色杯中,用生理盐水做对照,测得280nm和260nm两个波长的光密度.
【计算】
将测得280nm和260nm波长的光密度值按下列经验公式计算蛋白质浓度.
蛋白质浓度（mg/mL）=1.45D280－0.74D260
【附注】
1、不同的蛋白质和核酸的光吸收率不完全是恒定不变,所以可能产生误差.另外核酸中的嘌呤碱,嘧啶碱在波长260nm和280nm都有光吸收作用.所以核酸的含量在20%以下,D280/D260>1.5时,方可以使用上述公式.
2、本法对于微量蛋白质的测定即快又方便,它还适应于用硫酸铵或其他盐类提纯的蛋白质样品（这种蛋白质样品含多种盐类混杂,用其他方法测定比较困难）.
3、如纯系蛋白质样品,可根据该蛋白质在280nm附近标准吸光系数,直接测定该蛋白质的含量.如牛血清白蛋白的EI280(%)为6.3测定时,按下列公式计算.
样品中牛血清白蛋白浓度（mg/mL）=D280/6.3×10
4、为简便起见,对于混合蛋白质溶液,可用D280乘以0.75来代表其中蛋白质的大致含量（mg/mL）.

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