作业帮如何从大肠杆菌中提取染色体DNA
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：生物作业 时间：2024/05/11 19:01:48
如何从大肠杆菌中提取染色体DNA
大肠杆菌中染色体DNA的抽提
(1)大肠杆菌一级瓶培养过夜,以10%的接种量接二级瓶培养4～5小时后,培养物以50ml/管离心收获(8 000 rpm,5min,4℃).
(2)菌体沉淀中加入10ml BufferA,旋涡振荡混匀,37℃保温30分钟.
(3)取出后加入10% SDS至最终浓度为1%,轻轻混匀,37℃保温30分钟澄清即可.
(4)取出后加入20mg/ml的ProK至最终浓度为5mg/ml,60℃保温1小时.(染色体DNA结合蛋白的消化)
(5)取出后加入预冷的5M NaCl至最终浓度为1M,混匀后冰浴30分钟(溶液要混合成为均相,并且冰浴要充分,时间可适当延长).
(6)取出后4℃,15 000 rpm离心30分钟.(离心前样品管要进行平衡,以免离心机受损)
(7)在上清液中加入6ml苯酚和6ml氯仿混合液,混匀,室温下12,000rpm离心30分钟.
(8)在上清液中加入10ml氯仿,混匀,室温下12 000rpm离心30分钟.
(9)取上清液,加一倍量异丙醇沉淀DNA,冰浴放置30分钟,15 000rpm离心30分钟.
(10)75% 冰乙醇洗涤5分钟.
(11)晾干后,用300ml无菌双蒸水溶解染色体DNA,在37℃水浴中放置30分钟.
(12)用2～2.5体积的无水乙醇沉淀(加入pH5.5的KAc 0.1体积).
(13)沉淀洗涤,抽干后用ddH2O溶解,分装并保存于-20℃.
(1)大肠杆菌一级瓶培养过夜,以10%的接种量接二级瓶培养4～5小时后,培养物以50ml/管离心收获(8 000 rpm,5min,4℃).
(2)菌体沉淀中加入10ml BufferA,旋涡振荡混匀,37℃保温30分钟.
(3)取出后加入10% SDS至最终浓度为1%,轻轻混匀,37℃保温30分钟澄清即可.
(4)取出后加入20mg/ml的ProK至最终浓度为5mg/ml,60℃保温1小时.(染色体DNA结合蛋白的消化)
(5)取出后加入预冷的5M NaCl至最终浓度为1M,混匀后冰浴30分钟(溶液要混合成为均相,并且冰浴要充分,时间可适当延长).
(6)取出后4℃,15 000 rpm离心30分钟.(离心前样品管要进行平衡,以免离心机受损)
(7)在上清液中加入6ml苯酚和6ml氯仿混合液,混匀,室温下12,000rpm离心30分钟.
(8)在上清液中加入10ml氯仿,混匀,室温下12 000rpm离心30分钟.
(9)取上清液,加一倍量异丙醇沉淀DNA,冰浴放置30分钟,15 000rpm离心30分钟.
(10)75% 冰乙醇洗涤5分钟.
(11)晾干后,用300ml无菌双蒸水溶解染色体DNA,在37℃水浴中放置30分钟.
(12)用2～2.5体积的无水乙醇沉淀(加入pH5.5的KAc 0.1体积).
(13)沉淀洗涤,抽干后用ddH2O溶解,分装并保存于-20℃.
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