作业帮RT-PCR的引物如何设计?
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：生物作业 时间：2024/05/09 17:06:46
RT-PCR的引物如何设计?
本人刚接触RT-PCR,需要从其它几个物种基因的保守序列中,设计出另一个物种这个基因RT-PCR引物,但是实在是一头雾水,
本人刚接触RT-PCR,需要从其它几个物种基因的保守序列中,设计出另一个物种这个基因RT-PCR引物,但是实在是一头雾水,
引物可以通过一些软件设计,比如primer 5 ,但是还需要注意一些细节问题.
比如
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计.DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的.在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment）,各基因相同的序列就是该基因的保守区.
2.引物长度一般在15~30碱基之间.引物长度（primer length）常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应.
3.引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃.GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应.上下游引物的GC含量不能相差太大.另外,上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度.有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃.若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳.
比如
1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计.DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的.在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment）,各基因相同的序列就是该基因的保守区.
2.引物长度一般在15~30碱基之间.引物长度（primer length）常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应.
3.引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃.GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应.上下游引物的GC含量不能相差太大.另外,上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度.有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃.若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳.