两个PCR片段的overlap

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/05/10 14:25:11

两个PCR片段的overlap
我现在需要将片段1(1900bp)和片段2(1800bp)连接起来.片段1的上下游引物分别为1a,1b.片段2的上下游引物分别为2a,2b.1b 和2a是反向互补的,约22个碱基,现在我已分别通过1a-1b,2a-2b扩增出片段1和2（酶用的是高保真酶primerstart）,并进行了胶回收,然后通过1a(Tm值：47)和2b（Tm值：49）进行overlap PCR,退火温度是40°5个循环,45°25个循环,延长时间均为4min,结果没有出现目的片段,都做了好几次了,只有引物二聚体.有一次做出来是弥散一片,是我模板加多了?财富没有了~

Overlap PCR开始几个循环模板本来就是当引物使用的,所以模板可以多加,1和2都加到100ng左右.
你没有告诉我1b(2a)的Tm,Overlap的前几个循环要考虑两个模板互补的Tm.你的退火温度太低了,特异性不够强（除非你的Taq酶对退火温度有特殊要求,这个我不知道）.
我的建议：前10个循环,用1a,1b,2b中最低的Tm做退火温度,适当延长退火时间.后25个循环用1a,2b中最低的Tm做退火温度,正常退火时间（和你Taq酶的要求有关）.你模板链长度不小,不要怕多加模板.
再问：你好，非常感谢你的答案！！我查看了一下，1b和2a的Tm值均是46.65°，他们是反向互补的。你的意思是在配置PCR体系时还是要把1a和2b及酶都加进去，前10个循环用46°做退火温度，后25个循环再用47°做退火温度，退火温度均为30s，延长时间为4min?不知道这样行不行？
再答：嗯，这个体系我觉得挺合理的，你可以试一试。
再问：好的！！感谢！！尝试后我告诉你结果！！
再答：还有，一般在初始阶段就可以加入引物1a，2b，这样可以可以增加片段1，2在反应体系中的数量，使1，2之间有更大机会可以互补配对，不用先跑十几个回合再加引物。我一般这么做成功率还是很高的。再有，如果PCR后目的条带产量不高，可以凝胶回收，再跑一次PCR，这样目的产物的量就肯定足够了。
再问：你好，今天跑胶，已经看到目的条带了！！呵呵，太高兴了，但是还是有几条非特异性的扩增条带，而且我用rTaq酶可以P出来，用primerstart高保真酶就P不出来了~~只有非特异性的条带，这是为什么啊？是因为酶的效率不高吗？
再答：高保真只是proofreading防止错配的能力提高几十倍，酶的复制效率要比普通taq差，不出东西的时候少用高保真酶。有目的条带就行了，切胶回收，以其为模板再做一次普通PCR就不会有非特异性扩增了。另外，给你介绍一种新的taq酶，功能很强大，http://www.neb.com/nebecomm/products/productf-530.asp。就不知道现在国内有没有卖。

我在做overlap PCR,两个片段一条736bp,一条255bp,20个重叠碱基,四个引物的TM值都是59度,两条都谁可以简单罗列下做OVERLAP PCR的要点吗?最好图解原理以及引物设计时候注意事项 PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别? 为什么PCR引物可以决定被合成片段的大小 PCR仪一般每分钟扩增多长的片段 PCR为什么能扩增特意的基因片段呢对于一段有重复序列的片段如何扩增,只是一个基因的中间的部分序列,准备扩增做overlap. PCR 产生比目的片段小的片段,这是怎么回事,怎么样处理? 绝对定量PCR/荧光定量pcr 用途/半定量pcr/pcr荧光测定/pcr片段纯化 realtime PCR 做实时荧光PCR,就用染料的那种,是不是有要求PCR的片段,一般在100BP左右? 描写温暖的两个片段! pcr扩增目的片段时,在第几个循环后才能出现目的片段长度的双链DNA分子?