肝脏组织中atf2 基因cDNA的PCR程序

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/05/14 11:22:07

肝脏组织中atf2 基因cDNA的PCR程序
快纠结死我了,我用以下程序跑电泳出来的结果几乎总是弥散,看不到目的条带.
F:CCGAGATCTatgagtgatgacaaaccctttctat 有BGI2 酶切位点
G:CCGGTTAACtcaacttcctgagggctgtg 有HPA1 酶切位点
atf2基因,有两个isoform,一个1441bp,一个1321bp.
PCR程序如下：
94℃ 5min,
94℃ 30s,65℃30s,68℃2min,这里14个循环直至退火温度降到60℃,
接下来94℃30s,60℃35s,72℃2min,这里一共35个循环,
最后72℃10min.
哪里不对吗?
PCR是50uL体系，模板加了1ul

RNA提质量怎么样?CDNA模板浓度,引物浓度,退火温度都有比较大的影响,需要自己摸索
再问：跟加样过程有关系吗?没有提过RNA。。
再答：没有提RNA哪来的CDNA吖？退火温度是引物和模板结合的关键，不是有关系而是相当重要！还有才注意到你的目的基因很长，超过1KB的片段不容易出来的，要反复摸索条件
再问：其实额是新手，cDNA模板是师姐提供的，上游引物TM68，下游引物TM72.。退火温度设置的是不是需要调高一些呢，如果做梯度PCR，可以设成60-68的梯度吗？
再答：梯度可以试试，另外我觉得你的引物好长啊，目的基因也长，这样的情况本来就不容易P出来，再就是师姐的模板浓度够吗？这个也有影响
再问：模板浓度好像有1.04多ug/uL
再答：浓度可以。一般引物18-24bp是比较理想的，你的太长了，这样的话Tm值很高，退火温度都跟延伸温度一样了，所以反应条件还要再推敲。你确定引物合适吗？反正我没用过这么长的。多跟导师沟通改进方法，我们实验室摸索PCR条件连镁离子和taq酶浓度都要摸，所以别心急，一步一步早晚会出来的

我想做胰岛素导入大肠杆菌的基因克隆实验.在ncbi中查找到了cdna,准备跑pcr,这个时候需要提取出cdna模针对mRNA上的某个基因设计逆转录PCR的引物,逆转录时得到的cDNA只是这个基因的cDNA吗? 组织提取的cDNA和细胞提取的cDNA用同一引物PCR扩增出来的条带长度不一样,是什么原因?有什么方法改进吗要做组织提取RNA 逆转录为cDNA 进行实时PCR 请问实验组和对照组的组织要取等量的吗? PCR实验中加cDNA模板量是否要一致? 您好!我需要从cDNA调取一段基因,引物已经设计好,在PCR过程中不知如何调整体系,P不出目的条带? Rt-pcr EB 染色cDNA是什么原因使其在染色后的不到cDNA条带组织匀浆法制备小鼠肝脏过氧化氢酶粗提液实验中肝脏的解剖位置在哪?如何进行取材 real-time PCR中内参基因的CT值关于基因文库的问题A、cDNA文库中只含有某种生物的部分基因,基因组文库中含有生物的全部基因.B、cDNA文库中的所有基已知一个cDNA的3'端部分序列,得到该基因的全长cDNA 下列哪种方法不能获取目的基因：1从基因组文库中获取2从cDNA文库中获取3利用pcr合成4用RNA合成仪用化学方法合成