作业帮MTT比色法测细胞活力的步骤
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：生物作业 时间：2024/05/13 07:56:27
MTT比色法测细胞活力的步骤
四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝
操作步骤
一、接种细胞
1、用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞,将细胞收集到含血清的培养基中.
2、离心细胞悬液,使细胞沉积下来.用培养基重悬细胞,计数.
3、将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml,每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液.
4、用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液,每孔加0.5×103-10×103 个细胞.
5、将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中.第1列作读板议的空白对照.
6、将培养板放至塑料饭盒中,于37℃湿润环境中温育1-3天,等细胞进入指数生长期时可加入药物.
二、添加药物
1、用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释,共制备8个浓度.
2、对于贴壁生长的细胞,去除第2-11列各孔的培养基.
3、在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基,这些细胞作为对照.
4、在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物.每个药物浓度仅需4个孔,这样A-D行可用于第一种药物,E-H行用于第二种药物.
5、向每组4 孔中各加入200μl药物溶液.
6、将培养板放回塑料盒中,温育至确定时间.
三、生长期
1、在药物作用期结束时,去除所有含有细胞的孔中的培养基,加入200μl新鲜的培养基.
2、每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间].
四、存活细胞数的估算
1、在生长期末,每孔中各加入200μl新鲜的培养基,在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT.
2、用铝箔包裹培养板,于37℃湿润环境中温育4 h.
3、弃去孔中的培养基和MTT,在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO,以溶解残留的MTT-甲臜结晶.
4、在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液（每孔25μl）.
5、立即在570nm处记录吸光值.读板仪用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零.
五、分析
以药物浓度为横坐标（X轴）,吸光值为纵坐标（Y轴）绘制曲线图.第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值,对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50 浓度.
操作步骤
一、接种细胞
1、用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞,将细胞收集到含血清的培养基中.
2、离心细胞悬液,使细胞沉积下来.用培养基重悬细胞,计数.
3、将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml,每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液.
4、用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液,每孔加0.5×103-10×103 个细胞.
5、将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中.第1列作读板议的空白对照.
6、将培养板放至塑料饭盒中,于37℃湿润环境中温育1-3天,等细胞进入指数生长期时可加入药物.
二、添加药物
1、用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释,共制备8个浓度.
2、对于贴壁生长的细胞,去除第2-11列各孔的培养基.
3、在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基,这些细胞作为对照.
4、在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物.每个药物浓度仅需4个孔,这样A-D行可用于第一种药物,E-H行用于第二种药物.
5、向每组4 孔中各加入200μl药物溶液.
6、将培养板放回塑料盒中,温育至确定时间.
三、生长期
1、在药物作用期结束时,去除所有含有细胞的孔中的培养基,加入200μl新鲜的培养基.
2、每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间].
四、存活细胞数的估算
1、在生长期末,每孔中各加入200μl新鲜的培养基,在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT.
2、用铝箔包裹培养板,于37℃湿润环境中温育4 h.
3、弃去孔中的培养基和MTT,在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO,以溶解残留的MTT-甲臜结晶.
4、在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液（每孔25μl）.
5、立即在570nm处记录吸光值.读板仪用第1 列中含培养基和MTT但不含细胞的各孔调零.
五、分析
以药物浓度为横坐标（X轴）,吸光值为纵坐标（Y轴）绘制曲线图.第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值,对照组吸光值减少一半时所需的药物浓度为IC50 浓度.