RT-PCR 刚刚换了新的mmlv和RRI,其他的oligodt,dntp,taq,引物等试剂都至少半年了.

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/05/29 10:59:32

RT-PCR 刚刚换了新的mmlv和RRI,其他的oligodt,dntp,taq,引物等试剂都至少半年了.
没换新试剂之前做了几次,每次都是marker很清楚,目的条带和内参都没有,每个通道只在100bp位置有条带,就认为是二聚体引物.RNA纯度测定结果都在2附近,认为问题可能在反转部分,但是昨天换了新的mmlv和RRI之后,结果还是不理想.做了四个样,同一只小鼠的,1和2是心肌,3和4是肾脏,1和3扩的是目的基因ACE,2和4扩的是GAPDH.跑电泳的结果是marker很清楚,1和3没有任何条带,2和4在100bp附近有一条亮带.这是什么原因啊?我想反转录之后就检测一下有没有cDNA该用什么方法.我该在什么地方找问题呢.

问题很多.
1、你的GAPDH扩增预计多长,因为100bp可不像二聚体；
2、ACE引物设计如何,从哪里获得的?国内文献的引物绝对需要核实,SCI文献来的最好也核实,到ncbi blast一下；
3、可以提取染色体DNA做一个PCR看看做个对照；
4、反转用的什么引物,oligo还是randem,还是特异性的引物?
5、RT-PCR体系要根据实际情况优化的.
再问：谢谢你的帮助。 1，gapdh预计扩增三百多bp，二聚体的话应该在什么位置呢。 2，引物是invitrogen合成的，是导师查的国外文献找公司合成的。我是最近半年才接受，之前的试剂购买、摸索体系等工作都是另一个老师做的，他说只有第一次做的时候结果理想，后面几次有条带但不理想，再后来就什么都没有只有100bp的条带。 4，反转我用的是takara的oligo dt 18，试剂都是takara的。
再答：二聚体位置还靠前，比50还小。就是说连内参都不对。一直有100bp，是不是产物污染了你的某些试剂。用DNA试试，条件要按照DNA的来，而且带可能比较多，以确认引物没问题。最后再确认RNA和cDNA没问题。cDNA也可以测OD，但你需要的量会比较大，所以一般不测

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