RNAi发卡式载体构建及转化

RNAi发卡式载体构建及转化
1.利用反向遗传学研究基因功能的策略有哪些?2.RNAi的分子机制.3.RNAi的生物学意义如何?

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　通过灭活基因确定未知基因功能
采用实验技术在分子水平上灭活特定基因,然
后从整体上观察表型改变,可以推测相应基因的功
能.灭活特定基因的方法有以下几种.
1.1.1 　基因敲除(gene knockout)
早期,人们用基因敲除将一个结构已知但功能
未知的基因剔除,或用其他顺序相近基因取代,然后
从表型改变推测相应基因的功能.比如Mota 等通
过基因敲除技术研究TRA P 基因在伯氏与约氏疟
原虫中的功能及其差异[2 ] .传统的基因敲除方法
虽然可以确定一些基因的功能,但存在技术要求高、
操作过程烦琐、花费大等方面的弱点,在一定程度上
限制了它的广泛应用.
1.1.2 　反义RNA(antisense RNA)
反义RNA 作为反向遗传学的另一种方法,曾
广泛应用于研究基因功能,至今在基因功能鉴定上
仍发挥着作用.Yao 等利用反义RNA 下调基因表
达,分析了利什曼原虫表面蛋白水解酶的重要作
用[3 ] .但是用反义RNA 关闭基因表达具有作用较
弱等缺点.
1.1.3 　RNA 干扰(RNA interference ,RNAi)
外源和内源性双链RNA ( double2st randed
RNA ,dsRNA) 在细胞内诱导同源序列的基因表达
受到抑制的现象称为RNA 干扰,是1998 年由Fire
首次发现并命名的转录后水平的基因沉默,是《Sci2
ence》和《Nature》评出的2002 年度最重要的科技成
果之一,以其简单有效的特点正成为替代其他基因
灭活方法的重要的反向遗传学研究工具.
1.2 　基因过表达( gene overexpression)
Simonet 等利用此技术研究小鼠,用含有仅在
肝细胞中表达的高活性启动子使小鼠过表达OPG
(osteoprotegerin) 基因,得到的转基因小鼠的骨密度
明显高于正常小鼠,说明该基因参与骨质合成[4 ] .
1.3 　其他研究基因功能的方法
定点诱变( site2directed mutagenesis) 或体外诱
变( in vit ro mutagenesis) 可以用来探索基因的具体
功能.使用各种定点诱变或体外诱变可以缺失或改
变基因中的部分序列,而大部分序列不改变,这样仍
可合成蛋白质,并保留主要活性.通过这种方法可
以研究基因中某些序列编码的氨基酸在整个蛋白质
中所起的作用,如可能是控制蛋白质在细胞中的定
位或者负责蛋白质对化学信号的反应等;利用定点
诱变还可以产生基因的突变体,比较突变体与原基
因的功能差异,可进一步认识基因的功能.如黄长
晖等通过体外定点诱变生成抑癌基因P16 的P48L
和D74N 突变体来研究该基因的功能[5 ]
此外,基因功能的线索可以通过研究基因表达
的时间和空间来获得.如果基因的表达限制在多细
胞生物的特定器官或组织,或者器官或组织中的某
类细胞,那么这种定位信息就可以用来推测基因产
物的一般功能.
2 　以RNAi 为基础的反向遗传学在寄生虫研究中
的应用
2.1 　概述
RNAi 作为反向遗传学的一种方法,为后基因
组时代的基因功能分析提供了一个可靠而又快速的
应用平台.RNAi 克服了传统的基因剔除、转基因
等方法的弱点,以其快速、可靠、经济的特点受到越
来越多生物学家的重视.RNAi 正广泛应用于基因
功能研究.
Kiehl 等将在秀丽隐杆线虫( Caenorhabditis ele2
gans) 肌肉和神经组织中高度表达的未知功能的
at x22 基因和f ox21 基因的双链RNA 分别导入L4
期幼虫体内触发产生RNAi ,发现at x22 基因表达被
干扰后,幼虫的下一代胚胎发育受到抑制;当f ox21
基因表达受到干扰时,成虫的产卵率明显下降.从
而得知at x22 基因和f ox21 基因的表达分别与胚胎
发育和成虫生殖有关[6 ] .Fraser 和Conczy 等合成
了大量与开放读框相对应的特异性的dsRNA 以及
表达这些dsRNA 的细菌克隆,结合子代分析和时间
推移差异干扰比较显微分析( time2lapse differential
interference cont rast microscopy assay) 的方法,成功
地在基因组水平上大规模地筛选了功能基因,证明
了秀丽隐杆线虫一号、三号染色体上与早期胚胎细
胞分裂及细胞代谢等相关基因的功能[7 ,8 ] .Vayssie
等在溶组织内阿米巴中通过RNAi 证明了γ2微管蛋
白对于微管成核作用(microtubule nucleation) 的重
要性[9 ] .Levashina 等用dsRNA 敲除蚊虫的一种补
体样蛋白基因,证明了它在昆虫与脊椎动物免疫吞
噬作用中的功能具有保守性[10 ] .Blandin 等用
dsRNA直接注射敲除蚊虫的防御素基因( defensingene) ,证明了它的功能[11 ] .Bettencourt 等通过注
射dsRNA 到cecropia pupae 来沉默其Hemolin 基因
揭示了它对下一代的胚胎正常生长具重要作用[12 ] .
第二个和第三个书上《基因表达与调控》有的.