吸附薄层层析与分配,离子交换薄层层分析的区别

吸附薄层层析与分配,离子交换薄层层分析的区别

离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法.1848年,Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象.本世纪40年代,出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂.50年代,离子交换层析进入生物化学领域,应用于氨基酸的分析.目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法,广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化.常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂 .
　　离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成.带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂.离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化.由于蛋白质也有等电点,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同.阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将
　　吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来.结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来.反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来.
　　⒈离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒,以保证有较好的均匀度,对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤.溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理,使之成为带H+或OH-的交换剂型.阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理,使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理,使最终转为-H-型交换剂.洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度.已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡.为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层,要适当加压装柱,同时使柱床压紧,减少死体积,有利于分辨率的提高.柱子装好后再用起始缓冲液淋洗,直至达到充分平衡方可使用.
　　⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度,所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围,同时要注意离子强度应低,可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的.样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前,以离心法除去.为了达到满意的分离效果,上样量要适当,不要超过柱的负荷能力.柱的负荷能力可用交换容量来推算,通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％.
　　洗脱：已结合样品的离子交换前,可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱,也可同时改变pH与离子强度.为了使复杂的组份分离完全,往往需要逐步改变pH或离子强度,其中最简单的方法是阶段洗脱法,即分次将不同pH与离子强度的溶液加入,使不同成分逐步洗脱.由于这种洗脱pH与离子强度的变化大,使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱,纯度较差,不适宜精细的分离.最好的洗脱方法是连续梯度洗脱,洗脱装置见图16-6.两个容器放于同一水平上,第一个容器盛有一定pH的缓冲液,第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液,两容器连通,第一个容器与柱相连,当溶液由第一容器流入柱时,第二容器中的溶液就会自动来补充,经搅拌与第一容器的溶液相混合,这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化.第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：
　　C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
　　式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比.当A1＝A2时为线性梯度,当A1＞A2时为凹形梯度,A1＞A2时为凸形梯度.
　　洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大,一般要几十倍于床体积,从而使分离的各峰不致于太拥挤.②梯度的上限要足够高,使紧密吸附的物质能被洗脱下来.③梯度不要上升太快,要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态.目的物的过早解吸,会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽.
　　⒊洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定,得到层析图谱.依实验目的的不同,可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置,并回收目的物.
　　⒋离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生.如离子交换纤维素可用2mol/：NaCl淋洗柱,若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生,也可用乙醇洗涤,其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水.保存离子交换剂时要加防腐剂.对阴离子交换剂宜用0.002％氯已定（洗必泰）,阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005％）.有些产品建立用0.02％叠氮钠.
　　⒌离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域.在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质,也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子.
　　概念
　　层析是“色层分析”的简称.利用各组分物理性质的不同,将多组分混合物进行分离及测定的方法.有吸附层析、分配层析两种.一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等的分析.
　　层析（chromatography）利用物质在固定相与流动相之间不同的分配比例,达到分离目的的技术.层析对生物大分子如蛋白质和核酸等复杂的有机物的混合物的分离分析有极高的分辨力.
　　[编辑本段]语源学
　　chrome意为“色彩”,graphy源自希腊文,意为“写”.色谱为层析的同义语,都是从英语chromatography译来的.
　　层析（色谱） chromatograpby
　　在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相,把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中,使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动,利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差,将它们彼此分离开的定性与定量分析方法,称为层析,亦称色谱法.根据移动相种类的不同,分为液体层析、气体层析二种.用作固定相的有矽胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等,或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体,也可使用其他物质.将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatogra-phy）,在玻璃板上涂上一层薄而均的物质作为固定相的称为薄层层析（thin-layer chromatography）,后者可与用滤纸作为固定相的纸上层析进行同样的分析,即在固定相的一端,点上微量试料,在密闭容器中,使移动相（液体）从此端渗入,移动接近另一端.通过这种展开操作,各成分呈斑点状移动到各自的位置上,再根据Rf值的测定进行鉴定.当斑点不易为肉眼观察时,可利用适当的显色剂,或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察.也可采用在第一种移动相展开后再用另一移动相进行展开（这时的展开方向应与原方向垂直）,使各成分分离完全的双相层析（two-dimensional chromatography）.分离后,将斑点位置的固定相切取下来,把其中含有来自试料的物质提取进行定量分析.但为制备与定量,柱层析则更为适宜.在柱层析中,移动相从加入试料的一端展开到达另一端后,继续展开使各成分和移动相一起向柱外分别溶出,这就是广泛使用的所谓洗提层析（elution chromatography）.层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型（离子交换层析）等三种类型.但这并不是很严格的,有时常见到其中间类型.此外,近来也应用亲和层析,即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上,再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质.
　　[编辑本段]类别
　　◆按层析的机理划分：
　　吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等.
　　吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异,达到分离鉴定的目的.
　　分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不同,使之分离.
　　离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同.
　　凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同.
　　◆按流动相与固定相的不同划分：
　　气相层析、液相层析.这两大类层析是以流动相不同来划分的.如同时区分流动相和固定相,划分为：气固层析、气液层析、液固层析和液液层析等.
　　◆按操作形式划分：
　　柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等.
　　柱层析：将固定相装于柱内,使样品沿一个方向移动而达到分离.
　　纸层析：用滤纸做液体的载体,点样后,用流动相展开,以达到分离鉴定的目的.
　　薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层,以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定.
　　以上划分无严格界限,有些名称相互交叉,如亲和层析应属于一种特殊的吸附层析,纸层析是一种分配层析,柱层析可做各种层析.
　　[编辑本段]基本原理
　　层析须在两相系统间进行.一相是固定相,需支持物,是固体或液体.另一相为流动相,是液体或气体.当流动相流经固定相时,被分离物质在两相间的分配,由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡,即不断经历吸附和解吸的过程.随着流动相不断向前流动,被分离物质间出现向前移动的速率差异,由开始的单一区带逐渐分离出许多区带,这个过程叫展层.
　　系数K是物质在两相中的浓度比.K值大,则在固定相中吸附牢,K值小吸附差.各物质间的K值差别大,则易被分离.不同类型层析的K值含义不同,可视为吸附平衡常数,分配常数或离子交换常数等.
　　研究层析现象而发展的塔板理论,与有机化学实验中的分馏法原理有些相似.被分馏的有机溶剂在分馏柱内的填充物上形成许多热交换层,从而把低沸点溶剂先分馏出来,达到纯化的目的.在层析时用理论塔板数n来衡量层析效能.
　　tR为物质在层析柱上的保留时间,W为洗脱下来的物质峰形的宽度.n值愈大表示层析柱的效能愈高.如用理论塔板高度H表示,则包含了层析柱长度的因子.
　　式中L为层析柱的柱长.H值越大,则柱效越低.
　　此外影响层析分离效果的还有涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等因素.因此选择层析固定相支持物的粒度、均匀度等物理性能,流动相的层析系统和温度等都是做好层析的关键.
　　[编辑本段]几种常用的层析
　　◆吸附层析
　　吸附剂的吸附力强弱,是由能否有效地接受或供给电子,或提供和接受活泼氢来决定.被吸附物的化学结构如与吸附剂有相似的电子特性,吸附就更牢固.常用吸附剂的吸附力的强弱顺序为：活性炭、氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙、石膏、纤维素、淀粉和糖等.以活性炭的吸附力最强.吸附剂在使用前须先用加热脱水等方法活化.大多数吸附剂遇水即钝化,因此吸附层析大多用于能溶于有机溶剂的有机化合物的分离,较少用于无机化合物.洗脱溶剂的解析能力的强弱顺序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等.为了能得到较好的分离效果,常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合,得到合适洗脱能力的溶剂系统,以获得最佳分离效果.
　　◆分配层析
　　在支持物上形成部分互溶的两相系统.一般是水相和有机溶剂相.常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等,这些亲水物质能储留相当量的水.被分离物质在两相中都能溶解,但分配比率不同,展层时就会形成以不同速度向前移动的区带.
　　◆离子交换层析
　　支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子,如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等.带阳离子基团的,如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等为阳离子交换剂.带阴离子基团的,如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四级胺乙基）等为阴离子交换剂.离子交换层析只适用于能在水中解离的化合物,包括有机物和无机物.对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力.离子交换基团在水溶液中解离后,能吸引水中被分离物的离子,各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态,各种离子有不同的交换常数,K值愈高,被吸附愈牢.洗脱时,增加溶液的离子强度,如改变pH,增加盐浓度,离子被取代而解吸下来.洗脱过程中,按K值不同,分成不同的区带.
　　◆凝胶过滤层析
　　支持物是人工合成的交联高聚物,在水中膨胀后成为凝胶.凝胶内为内水层,凝胶周围的水为外水层.控制交联度以形成不同孔径的网状结构.交联度小的孔径大,交联度大的孔径小.凝胶只允许被分离物质中小于孔径的分子进入,大于孔径的分子被排斥在外水层,最先被洗脱下来.而进入孔径的分子也按分子量大小大致分离成不同的区带.选择不同规格的凝胶,可把一个混合物按分子量的差异分成不同的组分.这种方法曾被称为分子筛.目前常用的凝胶商品有：葡聚糖凝胶（sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（bio-gel）、琼脂糖凝胶（sepharose）和聚苯乙烯凝胶（styragel）等.
　　◆亲和层析
　　在一对有专一的相互作用的物质中,把其中之一联结在支持物上,用于纯化相对的另一物质.常见的亲和对如：酶和抑制剂,抗原和抗体,激素和受体等.支持物为琼脂糖或纤维素等.
　　◆气相层析
　　属于分配层析或吸附层析,仅适用于分析分离挥发性和低挥发性物质.固定相是在惰性支持物（如磨细的耐火砖）上覆盖一层高沸点液体,如硅油、高沸点石蜡和油脂、环氧类聚合物.外涂层约为支持物重量的20％.分析时操作温度范围,一般从室温到200℃.特殊的层析柱能达到500℃.流动相常用氦、氩或氮为展层气体.气相层析分离的区带十分清晰,是由于挥发性物质在两相间能很快达到平衡,所需分析时间大为缩短,一般为数分钟至10余分钟.检测记录系统绘出的各峰是测定流出气体电阻变化的结果,因而测定样品量可到微克和毫微克水平.具有快速、灵敏和微量的优点.气相层析也能用于分离制备样品,但需增加将流出气体通过冷冻将分离物回收的装置.
　　◆纸层析
　　以滤纸为支持物的分配层析.组成滤纸的纤维素是亲水物质,能形成水相和展层溶剂的两相系统,被分离物质在两相中的分配保持平衡关系.纸层析用于分析简单的混合物时可做单向层析.对于复杂的混合物,可做双向层析.1944年A．J．P．马丁第一次用纸层析分析氨基酸,得到很好的分离效果,开创了近代层析的发展和应用的新局面.70年代以后,纸层析已逐渐为其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法,如离子交换层析、薄层层析、高效液相层析等所代替.
　　◆薄层层析
　　在玻璃片、金属箔或塑料片上铺上一层约1～2毫米的支持物,如纤维素、硅胶、离子交换剂、氧化铝或聚酰胺等,根据需要做不同类型的层析.聚酰胺薄膜是一种特异的薄层,将尼龙溶解于浓甲酸中,涂在涤纶片基上,当甲酸挥发后,在涤纶片基上形成一层多孔的薄膜,其分辨力超过了用尼龙粉铺成的薄层.薄层层析较纸层析优越在于分辨高,展层时间短.例如用纸层析做氨基酸分析,往往需要两天时间,而且对层析条件要求严格,不易得到满意的分离效果.如用薄层层析做,一般约需半小时,分离效果更好.薄层层析一般用于定性分析.也能用于定量分析和制备样品.
　　◆高效液相层析（又名高压液相色谱）
　　70年代新发展的层析法.其特点是：用高压输液泵,压强最高可达5000psi（相当于34个标准大气压）.用直径约3～10微米的超细支持物装填均匀的不锈钢柱.常用的支持物是在玻璃小珠上涂一层1～2微米的二氧化硅,经硫酰氯反应生成Si—Cl,进一步连接疏水的烷基,如Si—C18H37,或阳离子交换基团—Si（CH2）n—C6H4SO3H,或阴离子交换基团—Si（CH2）nNH2.这种支持物能承受很高的压力,化学性能稳定.用不同类型支持物的HPLC,可做吸附层析、离子交换层析和凝胶过滤层析.其分析微量化可达10-10克水平.但用于制备,可以纯化上克的样品.展层时间短,一般需几分钟到10余分钟.其分析速度、精确度可与气相层析媲美.HPLC适于分析分离不挥发和极性物质.而气相层析只适用于挥发性物质,两者互为补充,都是目前最为理想的层析法.HPLC配有程序控制洗脱溶剂的梯度混合仪,数据处理的积分仪和记录仪等电子系统,成为一种先进的分析仪器,在生物化学、化学、医药学和环境科学的研究中发挥了重要作用.
　　◆反相层析
　　在吸附层析中,高极性物质在层析柱上吸附较牢,洗脱时发生拖尾现象和保留时间长的问题.如果在支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类,洗脱液用极性强的溶剂,如甲醇和水的混合物.则被分离样品中的极性强的物质不被吸附,最先洗下来,得到较好的分离效果.这种层析法与普通的吸附层析法相反,故称为反相层析.目前用HPLC做反相层析常用的ODS柱,即在支持物的表面上连接了C18H37Si—基团.
　　◆同系层析
　　在核酸分析中,将样品经核酸酶部分裂解成不同长度的核苷酸片段,用同位素标记后,在DEAE纤维素薄层上分离,用含有未标记的相同的核苷酸片段作展层溶剂,这样,未标记的核苷酸把标记过的核苷酸推进,使按分子量大小不同把标记核苷酸片段,按由小到大的次序排列,达到分离的目的.于是把这种层析法称为同系层析.同系层析和电泳相结合曾用于寡核苷酸的顺序分析.
　　纸层析是层析法的一种,要了解纸层法还得从层析法开始.层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography）,是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同,使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法.例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异,使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同,达到彼此分离的目的.
　　层析法的最大特点是分离效率高,它能分离各种性质极相类似的物质.而且它既可以用于少量物质的分析鉴定,又可用于大量物质的分离纯化制备.因此,作为一种重要的分析分离手段与方法,它广泛地应用于科学研究与工业生产上.现在,它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用.
　　层析根据固定相基质的形式分类,层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析.其中纸层析是指以滤纸作为基质的层析.