如何能够在双元载体里面插入目的片段

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：综合作业时间：2024/05/11 14:50:47

如何能够在双元载体里面插入目的片段
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1、用Sal I和BamH I双酶切得到目的片段,然后用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶等补齐,这样目的片段的2端都是平末端.
2、用BamH I单酶切载体,然后用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶等补齐,使载体的2端也成平末端.
3、将补齐后的目的片段连入补齐后的载体片段（目的片段无论是正向插入还是反向插入,BamH I酶切位点都没有了）.然后采用酶切的方法筛选、鉴定所需的重组质粒.即,在目的片段的5"端或3"端选择一个酶切位点（目的片段上只有唯一的一个,而且应该尽量靠近目的片段的5"端或3"端,只要能区分片段的大小就行）；此外,载体上应该没有该酶切位点.然后用所选择的酶切位点的相应内切酶和Sal I酶切,通过酶切产生的小片段的大小就可判断目的片段的插入方向,选择你需要的（正向插入,暂且命名为质粒1）.
4、用Sal I单酶切质粒1,再用Klenow Fragment或T4 DNA聚合酶等补齐,使质粒1的2端也成平末端.
5、将补齐后的目的片段连入补齐后的质粒1片段（目的片段无论是正向插入还是反向插入,Sal I酶切位点也都没有了）.同样,采用酶切的方法筛选、鉴定所需的重组质粒.即,在目的片段的5"端或3"端选择一个酶切位点（目的片段上只有唯一的一个,而且应该尽量靠近目的片段的5"端或3"端,只要能区分片段的大小就行）；此外,载体上应该没有该酶切位点（用上面所选的酶切位点应该就可以）.然后用所选择的酶切位点的相应内切酶酶切,通过酶切产生的小片段的大小就可判断目的片段的插入方向,选择你需要的反向插入就行了.

如何能够在双元载体里面插入目的片段本人实验,现在手上有pCDNA3.1-EGFP载体,现在想在载体上插入目的基因PTEN片段,应该怎么做? 构建基因表达载体时如何保证目的基因插入位置在启动子与终止子之间为什么目的基因不能直接插入载体? 构建RNA干涉载体时,正反向目的片段中间插入的内含子有何要求? 基因工程中如何避免载体的自我环化和目的基因的双向插入? 能不能用PCR直接扩增目的片段,然后转入表达载体,代替在克隆载体或dh5a中的扩增是不是插入目的基因的载体全都有标记基因? 目的基因片段与载体质粒的选择? 目的基因片段与载体DNA连接的主要有? 目的片段连接表达载体后酶切出非特异带为什么 word2007如何在插入的形状里面写入文字?