作业帮重组子PCR检测不出条带
来源：学生作业帮助网 编辑：作业帮 时间：2024/05/18 05:33:54
建议：循环次数减少3,Mg离子浓度降低到1.2mm,提高annealing的温度
既然其他样本有结果,说明引物没有问题.而该样本GAPDH也有,说明cDNA没有问题.PCR试剂也OK.目的基因在这个样本中表达很低.如果是做定量的话建议用realtime.这样肉眼看不到的也可以由荧光
那就是PCR的问题了,建议用新的试剂再试下,最好先把反应液,酶,引物按比例先配好,再取混合液加引物
1.引物设计不够特异,检查你的序列,去BLAST看看.2.退火温度过低,检查你的引物的Tm,检查你的程序设置.
菌落PCR的假阳性高很可能是因为你做PCR的循环数过大,我们实验室一般对于高拷贝数的质粒,循环数不会超过25个,一般用25个.我知道一家做这些,[威斯腾生物].感觉还可以
1.先看下PCR电泳图里杂带多不多,若有的话很可能非特异性扩增了2.若条带干净,仍然有可能存在非特异性扩增,引物特异性不高导致竞争结合可将DNA直接酶切看是否能切出你的目标片段3.序列比对结果不能只看
别人给的质粒,第一要做的是转化保种啊,别人给那点哪够分析.转化完了自己抽质粒分析.质粒直接跑电泳理论上是三条带,要想分析建议做单酶切再电泳.再问：又做了一次，拿个质粒菌做阳性对照也都没有提出来。不知道
提交不了答案.不要调一致把内参也检测了
为啥要把内参调一致呢你每次都也检测一下内参不就好了然后用目的基因的比上内参一般很少有什么调一致的吧.
可能有很多原因,最常见的原因是1.模板不干净,2.引物设计不当,3.退火温度过高,等等
问题很多啊.或者是你的PCR仪需要进行荧光校准（如果其他探针也没有信号的话）,已经不能收集荧光信号了.或者是你的探针本身就有问题,合成的不好,信号很弱甚至没有信号.或者是你的探针存放时间太长,存放条件
一个可能原因,DNA结合了蛋白质,所以跑不出去.加loadingbuffer后加热（90度以上）一下再上样试试.另外一个原因,你的产物特别大（不一定是目标产物）再问：我做的是菌落PCR电泳检测结果，我
1、内参没有被扩增出来2、电泳时内参没加loadingbuffer或染料
恐怕还是cDNA的问题,actin因为量比较丰富,所以即使破坏一些仍能P出来,但你的目的基因就不同了
体系没啥调整的降低退火温度不行的话就换对引物再问：降低了啊，P出很多带，但是没有大小和目的条带相符的，我用的是KOD高保真酶，和选用的酶关系大吗？再答：一般关系不大如果实验室还有别的可以试一下应该是引
酶切位点消失啦,测个序看看.再问：测序了，说我的链接质粒没有信号再答：重新做吧，多半不对！
体系变化后会有些不同,但影响这么大,可能试剂没混匀,仪器孔加热不均一了,等等.如果25ul体系稳定,建议25ul就好.只是多P1管而已吧.
任何环节都有问题,我只能这么跟你说了
PCR扩增的结果和模板的质量有直接的关系,在PCR扩增中如果模板纯度高,很低的量都可以进行扩增的.提取细菌的DNA量不多但纯度高,即使DNA电泳检测不到条带,PCR仍然能扩出条带.希望你看明白了.
1退火温度不合适2引物不合适3模板有问题4酶由问题