基因cDNA全长扩增不出来 2k

DNA测序主要有两种方法：化学法和酶法主要步骤有：一端标记,碱基特异剪切.特定减机修室,然后进行凝胶电泳可以查一下：早期的化学法：MaxamGilbert化学法如今多用用四种DDNTP进行末端终止的s

通过LongPCR等技术首次克隆得到全长9388bp的牛催乳素(bPRL)基因组序列(GenBank登录号AF426315),其中包括bPRL基因全部5个外显子和4个内含子,5′端854bp的上游调控

原来扩增的时候就有两条带,回收的时候（是凝胶回收吗?）可能因为产物浓度过大,导致两条带没跑开,让你一起切下来了（回收后电泳检测了没?）,所以连接后有两种克隆.至于说为什么会出现两种克隆,要具体问题具体

copy到premier5.0设计出来的只是部分序列哦,无法表达的.需要把cDNA全长都设置进去,就是从起始密码子开始.再检查下你的表达载体有没有启动子这些元件.要表达一个基因考虑的东西挺多的哦,细心

1.首先这应该是个融合表达载体.应该考虑后面的读码框问题.就是应该适当在后面的酶切位点前加入0-2个碱基.使得你的目的基因和egfp在同一读码框内.2.KOZAK序列在真核细胞中表达有作用,这就看你后

理论应该用CDNA进行因为设计,但要保证你提取的mRNA的质量,尽量减少降解.可以在原序列基础上先写出互补序列再进行引物设计.

pcr扩增出来就是目的基因.假设这是一段基因（两条链一个道理我就只表示一条了）--------------+————————=-------------------中间是目的基因,=和+表示它的两端,

中间有一段未知没有关系啊,从两头已知的里面设计引物,然后进行PCR,克隆到载体上,或者PCR产物直接送去测序,测序结果blast即可

可能有很多原因,最常见的原因是1.模板不干净,2.引物设计不当,3.退火温度过高,等等

1先根据部分序列设计一对引物验证一下序列是否正确（很确信就免）,需要的话克隆,有文库的话杂一下文库；2根据已知序列设计三条巢式引物,进行5’RACE,拿到5’序列；3同时设计巢氏引物,进行3’RACE

cDNA由mRNA逆转录出一条链,再按照互补原则扩增出另一条链,从而形成双链DNA.与基因组相比,cDNA不包括非编码区的序列,也不包括内含子的序列,因此全长cDNA序列要比基因组序列少.

和从哪设计引物没关系如果编码区有突变的话那就肯定不行的最简单的就是拿去测序CDS区完全正确就可以了验证功能的话就做western以及检测该基因下游targets的表达量比如它可以促进A的表达就转染细胞

都不知道你已学了什么生物信息学知识,怎么回答?如别人前面回答的,可以定位位置,可以了解诶内含子,了解cDNA对应gDNA有多长,可以从cDNA翻译得到蛋白质,可以分析推算出来的蛋白质序列的一些性质,比

额

那是为了检测这个基因是否表达,而不是检测是否存在.只有表达的基因才会转录成RNA.

是的,就是你所想的一样.

非特异性条带的出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体.二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关.其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一

这要具体分析.一种可能是你的PCR产物是非特异性片段,所以长度不一,这可以通过和你预期PCR产物的长度进行比较来判断.另一种可能是该基因在不同情况下有不同的剪接模式（alternativesplici

连到载体后扩增有好处：载体相对于基因组或cDNA复杂度降低,扩增出的片段纯度比较高,而且循环数可以很低,如20-25循环切忌用载体扩增时用高循环,否则会有大量smear引物肯定需要加的!mg2+倒可以

1退火温度不合适2引物不合适3模板有问题4酶由问题