作业帮求提取毒种RNA方法新手初来乍到,实验要求进行毒种基因测序,我购买了TAKARA公司的miniBEST viral DN
来源：学生作业帮 编辑：作业帮 分类：生物作业 时间：2024/05/08 16:53:39
求提取毒种RNA方法
新手初来乍到,
实验要求进行毒种基因测序,我购买了TAKARA公司的miniBEST viral DNA/RNA EXtraction kit ver4.0试剂盒提取毒种RNA,毒种滴度在5.0-6.3之间,提取后保存在零下70度三天,后送测序公司,测序公司要求加乙醇后送检,但送到后,对方表示没有得到沉淀RNA.
因为我们公司局限,送检时没有电泳先检测,所以我也不知道是我没提出来,还是路上降解了,有什么好的方法提取毒种RNA.
新手初来乍到,
实验要求进行毒种基因测序,我购买了TAKARA公司的miniBEST viral DNA/RNA EXtraction kit ver4.0试剂盒提取毒种RNA,毒种滴度在5.0-6.3之间,提取后保存在零下70度三天,后送测序公司,测序公司要求加乙醇后送检,但送到后,对方表示没有得到沉淀RNA.
因为我们公司局限,送检时没有电泳先检测,所以我也不知道是我没提出来,还是路上降解了,有什么好的方法提取毒种RNA.
异硫氰酸胍提取法(这是提禽流感病毒的详细步骤,供参考)
1、取200ul样品数+阴性对照+阳性对照加入1.5ml灭菌eppendorf管；
2、加600ul异硫氰酸胍,然后加入对照和样品,再加200ul氯仿,颠倒混匀；
3、13000rpm离心15min；
4、在第3步离心快结束时,另取同样多eppendorf管,加入400ul于-20℃预冷的异丙醇；
5、取第3步离心的上清(一定不要吸取到中间白色层,第3步离心结束往外拿的时候,管子尽量不要倾斜)转移到第4步准备的管中,颠倒混匀；
6、13000rpm离心15min,轻轻倒去上清,在吸水纸上尽量沾干液体；
7、加600ul75％乙醇,颠倒数次以洗涤残存异丙醇；
8、13000rpm离心15min,轻轻倒去上清,在吸水纸上尽量沾干液体；
9、4000rpm离心10sec,将管壁残存液体甩到底部,用微量枪头吸干,室温干燥2－3min(不可过分干燥,防止下一步RNA不溶解)；
10、加入20ulDEPE水(加入depc的纯水高压后的水即为DEPE水),轻轻混匀溶解RNA.2000rpm离心5sec,冰上保存备用(最好2小时内使用,以免RNA降解).
1、取200ul样品数+阴性对照+阳性对照加入1.5ml灭菌eppendorf管；
2、加600ul异硫氰酸胍,然后加入对照和样品,再加200ul氯仿,颠倒混匀；
3、13000rpm离心15min；
4、在第3步离心快结束时,另取同样多eppendorf管,加入400ul于-20℃预冷的异丙醇；
5、取第3步离心的上清(一定不要吸取到中间白色层,第3步离心结束往外拿的时候,管子尽量不要倾斜)转移到第4步准备的管中,颠倒混匀；
6、13000rpm离心15min,轻轻倒去上清,在吸水纸上尽量沾干液体；
7、加600ul75％乙醇,颠倒数次以洗涤残存异丙醇；
8、13000rpm离心15min,轻轻倒去上清,在吸水纸上尽量沾干液体；
9、4000rpm离心10sec,将管壁残存液体甩到底部,用微量枪头吸干,室温干燥2－3min(不可过分干燥,防止下一步RNA不溶解)；
10、加入20ulDEPE水(加入depc的纯水高压后的水即为DEPE水),轻轻混匀溶解RNA.2000rpm离心5sec,冰上保存备用(最好2小时内使用,以免RNA降解).