土壤蔗糖酶活性采用3,5二硝基水杨酸比色法测定的详细步骤!

土壤蔗糖酶活性采用3,5二硝基水杨酸比色法测定的详细步骤!

土壤蔗糖酶测定（比色法）
1. 方法选择及原理
蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖.蔗糖酶活性的测定方法有用酶学的方法测量所产生的葡萄糖（滴定法或重量法）或是根据蔗糖的非还原性,用生成物（葡萄糖和果糖）能够还原菲林溶液中的铜,再根据生成的氧化亚铜的量求出糖的含量.也可根据蔗糖水解的生成物与某种物质（3,5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物进行比色测定.还有一种方法,根据蔗糖液酶促反应前后光偏振面的变化（旋光法）进行测定.
目前,我国常用的主要是硫代硫酸钠滴定法,它是测定土壤蔗糖酶活性的经典方法.3,5-二硝基水杨酸比色法重现性较好,且手续较简便,适于成批样品测定.
测定土壤蔗糖酶活性时,均以蔗糖为基质,蔗糖液浓度范围为5-20％.在酸性介质中,蔗糖酶活性最大.为保持该酶最适pH,多使用下列缓冲液：醋酸盐缓冲液（pH4.5-5.5）,磷酸盐缓冲液（pH4.9-5.5）,醋酸盐-磷酸盐缓冲液（pH5.5）. 2. 试剂配制
（1）3,5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸,溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中,再加18.2g酒石酸钾钠,用水稀释至100ml（不超过7天）.
（2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.867g Na2PO4•2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M 磷酸二氢钾（9.078KH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成. （3）8％蔗糖溶液. （4）甲苯.
（5）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下,真空干燥至恒重.然后取500mg溶于100ml 12mmol苯甲酸溶液中（5mg还原糖/ml）,即成标准葡萄糖溶液.
标准曲线绘制：取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml含5mg还原糖/ml的标准葡萄糖溶液到50ml容量瓶中,与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色. 3. 试验步骤
称取2.***g新鲜土,置于50ml三角瓶中,注入15ml 8％蔗糖溶液,5ml pH5.5磷酸缓冲液和0.25ml甲苯.摇匀混合物后,放入恒温箱,在37℃下培养24h.到时取出,迅速过滤.从中吸取滤液1ml,注入50ml容量量瓶中,加3ml 3,5-二硝基水杨酸,并在沸水的水浴锅中加热5min,随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min.
溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色,最后用蒸馏水稀释至50ml,并在分光光度计上于波长508nm处进行比色.
为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差,每一土样需做无基质（无蔗糖）对照,整个试验需做无土壤对照. 4. 结果计算
蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示. 葡萄糖（毫克）＝a×50×ts/m a－显色液中葡萄糖浓度（mg/ml）, 50－显色液体积（ml）；
ts－分取倍数（吸1ml滤液比色就是20/1）； m－烘干土质量（g）.