Ni-NTA纯化问题,获得不了纯的目的蛋白!

来源：学生作业帮编辑：作业帮分类：生物作业时间：2024/05/29 08:11:26

Ni-NTA纯化问题,获得不了纯的目的蛋白!
我们用的是导入质粒的大肠杆菌,然后用IPTG诱导,然后将细菌裂解.去掉细菌沉淀,上清过柱,然后用浓度为20mM,40mM,60mM,100mM,150mM,200mM的含有咪唑的洗脱液洗脱蛋白,20mM就有目的蛋白但是很杂,曾经缩小过咪唑的浓度,但是结果还是一样10mM也有目的蛋白,20mM的依然很杂,40mM的相对于20mM较纯,但也有一两条杂蛋白,60mM有时有目的蛋白有时没有,100mM几乎没有了以后的就都没有了.我们的目的蛋白分子量是30KDa左右,还总是由分解的蛋白,降低温度也没有什么效果,现在我很迷茫,我应该怎么处理,请前辈们,

这种情况在ni柱纯化时经常出现,你基本的方法没错,问题的根本原因是蛋白与填料的亲和力不够强,没法很好的洗脱杂蛋白,给你如下建议：
1,如果可行,在你的重组蛋白两端各加一个His-tag,这意味着你需要3天-7天的时间重新调整载体,这样会大大增强其亲和力,再用咪唑梯度洗就可以在20mM左右洗杂蛋白,在50-100mM左右洗目的蛋白,能较好的分离杂蛋白与目的蛋白；
2,如果重新构建不可行,对于你的先行体系,建议如下：
适当延长诱导表达时间,以增加目的蛋白含量；
在用咪唑梯度洗之前,先过3-5倍柱体积的buffer,先洗掉一部分杂蛋白,填料要保证已处理充分,既没有上次剩余的蛋白也有足够ni；
不要用这么多的梯度,有一点你需要明白,根据你现在的结果来看,60mM的咪唑是足以洗脱你的目的蛋白,而你的杂蛋白主要在20mM以下就洗差不多了,所以,你用buffer洗后,直接用5-10mM咪唑（用20mM洗的更干净,但目的蛋白肯定损失多,先试10mM）洗3-5个柱体积,以去除杂蛋白,再直接用60mM洗脱目的蛋白（也有可能60mM洗不下,那就试100mM）.
这样做的策略就是：较低咪唑洗杂蛋白,再一次性用相对较高咪唑洗目的蛋白.洗杂蛋白的咪唑浓度越高,时间越长,你的蛋白就越纯,但同时目的蛋白的损失也更大,这就需要你自己摸索合适的咪唑浓度和时间,以取得你需要的蛋白纯度和浓度.

带HIS蛋白用镍柱纯化后的保存问题动物细胞培养的目的是获得大量的分泌蛋白大肠杆菌表达带有GST标签的X蛋白,免疫家兔获得该融合蛋白的多克隆抗体血清,设计实验纯化X蛋白特异性抗体教各位大侠,在蛋白纯化时,MBP-目的蛋白融合蛋白在变性之后还能结合上MBP抗体的beads吗? GST纯化蛋白目前我的融合蛋白是40多Kd,GST标签是26.44,14点多Kd的目的蛋白,用GST纯化效果会如何,用H western blot 如何体外获得目的蛋白关于基因工程目的基因获得的问题, 组氨酸标签纯化蛋白挂不上柱子,蛋白的量还挺高的表达纯化蛋白过程中出现一条条带略小的非目的蛋白,且同样带有组氨酸标签,疑似转录时断裂造成的, 动物细胞培养的目的就是为了获得大量的分泌蛋白.为什么错? 动物细胞培养的目的是获得大量分泌蛋白这句话为什么是错的蛋白纯化的问题我是用镍柱纯化的蛋白非自然条件下的包涵体的但是跑sds-page没有条带或者是很不清楚,今天跑的什么